O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

赵宝磊，刘运超，陈玉梅，姬鹏超，王聚财，刘 畅，杨素珍，张改平,*

(1.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

O型口蹄疫病毒VP0和VP1蛋白的可溶性表达与反应原性分析

赵宝磊1，刘运超2，陈玉梅2，姬鹏超2，王聚财1，刘 畅2，杨素珍2，张改平1,2*

(1.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业部动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002)

为了高效可溶性表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP0、VP1结构蛋白，根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化合成VP0和VP1基因片段，并将其克隆到pE-SUMO载体中，构建重组质粒SUMO-VP0和SUMO-VP1，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达，并优化诱导温度、时间和IPTG浓度等表达条件。结果显示， SUMO-VP0可溶性蛋白表达的最佳条件为：20 ℃条件下，0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h；SUMO-VP1可溶性蛋白表达的最佳条件为：37 ℃条件下，0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h。 SDS-PAGE电泳和Western blot结果表明，表达的SUMO-VP0、SUMO-VP1可溶性蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别，具有很好的反应原性。

口蹄疫病毒； VP0、VP1结构蛋白； 可溶性表达； SUMO标签

口蹄疫病(foot and mouth disease,FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病，由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起，主要感染牛、猪、羊等多种偶蹄动物[1]。血清学试验和交叉保护性试验研究发现，FMDV主要存在7个血清型：A型、C型、O型、亚洲Ⅰ型、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南非Ⅲ型。这7个血清型之间没有交叉保护，且遗传变异频率非常高，流行范围非常广泛，给世界上许多国家的畜牧业生产造成了巨大的经济损失[2]。目前，免疫接种疫苗是防控该病的主要措施，接种的主要疫苗是弱毒苗和灭活苗，虽然这些疫苗具有很好的保护效果，但是制备成本高，还存在灭活不完全导致病毒暴发流行的危险。因此，对这2种疫苗的使用存在争议，迫切需要研究一种安全、高效、廉价的新型基因工程亚单位疫苗[3]。

FMDV为单股正链小RNA病毒，基因组全长有8 500个核苷酸，基因分为3个主要区域：5′UTR区、ORF区和3′UTR区。ORF区大约有7 000 nt，主要编码L蛋白、P1结构蛋白和P2、P3非结构蛋白。P1结构蛋白在后期的病毒翻译和修饰过程中被3Cpro蛋白酶裂解为3个主要的病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3。在病毒粒子的装配过程中，VP0、VP1和VP3先形成5S聚集体再形成14S颗粒体，最后由12个14S颗粒体组装成75S病毒的空壳蛋白体。VP1高度保守区的G-H环(140—160位)包含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列(RGD)，这些序列暴露在病毒粒子表面，构成病毒的细胞吸附位点[4]。VP0被3Cpro蛋白酶进一步裂解为VP2和VP4，VP4位于衣壳内部主要与核心RNA相连，是决定病毒抗原性的主要成分。另外，VP2和VP4经细胞激酶磷酸化后使FMDV的衣壳不稳定有利于核酸脱壳。VP2和VP1蛋白上含有多种具有免疫原性的抗原决定簇，是机体内中和性抗体结合病毒的靶标。因此，VP0和VP1结构蛋白成为亚单位疫苗研究的热点，但目前关于体外可溶性表达具有生物学活性的VP0和VP1结构蛋白的报道较少。

pE-SUMO载体是一种原核表达载体，主要用于促进重组蛋白质的正确折叠和增加蛋白质的水溶性。载体内含组氨酸标签和SUMO蛋白标签，这2种标签与目的蛋白融合表达不仅可以增加蛋白质的可溶性，还可以增加蛋白质的折叠效率[5-6]。鉴于此，采用pE-SUMO原核表达载体对FMDV VP0和VP1蛋白进行融合表达，以期获得表达量较高的可溶性重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1，为FMDV VP0和VP1蛋白的结构和功能及FMDV动物疫苗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 载体、质粒和菌株

大肠杆菌感受态细胞JM109和BL21(DE3)基因工程菌均购自TaKaRa公司。pE-SUMO原核表达载体和抗FMDV的阳性血清由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存。

1.2 主要试剂

核酸Marker DL2000、ExTaqDNA聚合酶、标准分子质量蛋白质Marker和T4 DNA连接酶等为TaKaRa公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自OMEGA公司；限制性内切酶XhoⅠ和BsaⅠ购自NEB公司；抗组氨酸标签单抗、HRP标记的羊抗鼠二抗及HRP标记的羊抗猪二抗均购自Abcam公司；IPTG购自INALCO公司；AEC显色试剂盒购自中杉公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计与FMDVVP0和VP1基因合成

猪O型FMDV结构蛋白VP0和VP1基因序列经优化后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,设计引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因。

表1 VP0和VP1基因的PCR扩增引物

注：下划线位置为酶切位点。

1.4 重组质粒的构建与鉴定

以合成的O型FMDV的VP0和VP1基因为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL：ExTaq12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加灭菌水补齐25 μL。PCR反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循环32次；72 ℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，通过胶回收试剂盒回收目的基因。用BsaⅠ和XhoⅠ对目的基因VP0、VP1和pE-SUMO载体进行双酶切并回收，随后用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜。采用CaCl2转化法将连接产物转入到感受态细胞JM109中，对经菌液PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序。将测序正确的阳性质粒命名为SUMO-VP0和SUMO-VP1，并转入感受态细胞BL21中用于重组蛋白的表达。

1.5 重组蛋白的诱导表达与Western blot鉴定

分别将SUMO-VP0和SUMO-VP1阳性重组表达菌按1∶100的比例接种到含有Amp+的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养菌体，当菌液的OD600=0.6时加入终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂IPTG，转至25 ℃振荡培养8 h。12 000 r/min离心15 min，弃上清，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬后用超声波破碎仪进行破碎。破碎后的液体12 000 r/min离心20 min。分别取40 μL的沉淀和上清,加入10 μL的5×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸10 min，煮沸后的样品用12%的SDS-PAGE检测。通过电转仪将蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上进行Western blot检测。转移后的NC膜置于5%脱脂奶中，4 ℃封闭过夜，用抗组氨酸标签单抗(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，再用1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗37 ℃孵育45 min，最后用AEC显色试剂盒显色并观察分析显色结果。

1.6 重组蛋白诱导表达条件的优化

分别将SUMO-VP0和SUMO-VP1的阳性菌接种于含Amp+的LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养，分别对诱导表达时间、诱导剂IPTG的浓度和诱导表达温度等进行优化。当OD600=0.6时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，在25 ℃条件下进行诱导表达，分别在诱导后的4、6、8、10、12 h收集菌液；在诱导温度25 ℃条件下，分别在0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导8 h收集菌液；在诱导剂浓度为0.5 mmol/L时，分别在16、20、25、37 ℃条件下诱导表达8 h收集菌液。分别将上述收集的菌液经12 000 r/min离心5 min，弃上清，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬后用超声波破碎仪进行破碎。破碎后的液体12 000 r/min离心20 min，分离沉淀和上清，分别用12% SDS-PAGE进行电泳鉴定。通过对各种条件的优化，选择最佳的诱导表达条件。

1.7 Western blot检测重组蛋白的反应原性

将诱导表达得到的重组蛋白电泳后转移到NC膜上，在5%的脱脂奶中4 ℃封闭过夜。用抗O型FMDV的阳性血清以1∶200稀释后作为一抗，37 ℃孵育1 h，再用1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗猪二抗37 ℃孵育45 min，用AEC显色试剂盒显色并观察显色结果。

2 结果与分析

2.1VP0和VP1基因的PCR扩增

分别用VP0-F/R和VP1-F/R引物扩增VP0和VP1基因，结果显示，分别在934 bp和668 bp处出现扩增条带，与预期目的条带大小一致(图1)。

M.DL2000 DNA Marker； 1.引物VP1-F/R扩增产物； 2.引物VP0-F/R扩增产物图1 VP1和VP0基因PCR扩增产物电泳结果

2.2 SUMO-VP0和SUMO-VP1重组质粒的构建

分别对PCR扩增后的VP0、VP1基因和pE-SUMO空载体质粒用BsaⅠ和XhoⅠ进行酶切，酶切后用T4 DNA连接酶连接，并转入到大肠杆菌JM109中。pE-SUMO载体经过双酶切后，酶切位点BsaⅠ对应的核苷酸序列发生变化，所以不能用BsaⅠ和XhoⅠ对重组的质粒进行双酶切鉴定。通过菌液PCR方法对挑选的单克隆进行鉴定，电泳结果显示，分别在934 bp和668 bp处出现阳性条带(图2)。对鉴定结果为阳性的质粒进行测序，测序结果与合成的序列相一致，表明成功构建SUMO-VP0和SUMO-VP1重组质粒。

2.3 SUMO-VP0和SUMO-VP1重组蛋白的诱导表达及可溶性分析

从图3可以看出，在约53 ku和43 ku处各有1条特异性的条带，与预测的SUMO-VP0和SUMO-VP1重组蛋白的大小相一致，且目的蛋白大部分以可溶性的形式存在。Western blot结果显示，SUMO-VP0和SUMO-VP1重组蛋白可以与抗组氨酸标签单抗发生特异性结合(图3)。

2.4 SUMO-VP0和SUMO-VP1重组蛋白诱导表达条件的优化

分别对重组蛋白的诱导表达时间、诱导剂IPTG浓度和诱导表达温度等进行优化。从图4可以看出，不同表达时间对SUMO-VP0的表达量影响比较大，在诱导12 h后表达量达到最高；而对SUMO-VP1影响较小，在8 h和12 h时表达量无明显差别，故选用诱导时间为8 h。

M.DL2000 DNA Marker； 1—4均为SUMO-VP0菌液； 5—8均为SUMO-VP1菌液图2 重组质粒的菌液PCR鉴定结果

M.蛋白质Marker； 1、2和5、6分别为SUMO-VP0超声后的沉淀和上清；3、4和7、8分别为SUMO-VP1超声后的沉淀和上清图3 重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的SDS-PAGE分析和Western blot检测结果

M.蛋白质Marker； 1—5和6—10分别是4、6、8、10、12 h诱导表达的SUMO-VP0和SUMO-VP1图4 重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1经不同时间的诱导表达情况

由图5可以看出，不同浓度IPTG对重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的表达并没有明显影响，在0.1 mmol/LIPTG诱导条件下，2种重组蛋白的表达量已经达到最高。由图6可知，重组蛋白SUMO-VP0在25 ℃条件下，可溶性表达量达到最高；在37 ℃条件下，重组蛋白的可溶性表达量和总体表达量均达到最低。因此，重组蛋白SUMO-VP0的最佳诱导温度为25 ℃。重组蛋白SUMO-VP1在不同温度条件下表达情况与SUMO-VP0相反，随着温度的升高，重组蛋白SUMO-VP1的表达量不断增加，在37 ℃条件下，可溶性蛋白表达量达到最高，说明37 ℃适合重组蛋白SUMO-VP1的可溶性表达。因此，SUMO-VP0可溶性蛋白的最佳表达条件为：20 ℃条件下，0.1 mmol/L IPTG诱导表达12 h；SUMO-VP1可溶性蛋白的最佳表达条件为：37 ℃条件下，0.1 mmol/L IPTG诱导表达8 h。

M.蛋白质Marker； 1—6和7—12分别为经0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mmol/L的IPTG诱导表达的SUMO-VP0和SUMO-VP1图5 重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1在不同IPTG浓度下的诱导表达情况

M.蛋白质Marker； 1、3、5、7和2、4、6、8分别为SUMO-VP0在16、20、25、37 ℃条件下表达超声后的沉淀和上清；9、11、13、15和10、12、14、16 分别为SUMO-VP1在16、20、25、37 ℃条件下表达超声后的沉淀和上清图6 重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1在不同温度条件下可溶性蛋白表达量检测结果

2.5 2种重组蛋白的反应原性检测结果

用抗O型FMDV的阳性血清通过Western blot检测重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的反应原性，结果(图7)表明，分别在53 ku和43 ku位置处的特异性条带能够被抗O型FMDV的阳性血清所识别，与抗组氨酸标签单抗检测结果相一致，说明获得的重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1均具有很好的反应原性。

M.蛋白质Marker； 1和2分别为SUMO-VP0的超声沉淀和上清； 3和4分别为SUMO-VP1的超声沉淀和上清图7 重组蛋白SUMO-VP0和SUMO-VP1的反应原性分析

3 结论与讨论

SUMO是一种小分子泛素类修饰蛋白，在细胞凋亡、信号转导和蛋白质的核质运输中发挥着重要作用[7-8]。最近研究发现，SUMO可以作为分子伴侣与重组蛋白融合表达，这种融合表达不仅可以抵抗蛋白酶水解重组蛋白，还可以促进蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的表达量，增加蛋白质的可溶性和稳定性[5-6]。SUMO标签可以通过SUMO蛋白酶酶切，切割之后不会留有残余氨基酸。姜媛媛等[9]将SUMO融合表达系统与pET-32a表达系统进行对比，结果表明，通过SUMO融合表达系统可以获得纯度较高的可溶性成熟蛋白，而目的蛋白在pET-32a表达系统中的表达量极低，几乎检测不到。曲栗等[10]利用SUMO表达系统高效表达鸡传染性法氏囊病毒的VP3基因，并且用SUMO蛋白酶酶切，得到的VP3蛋白通过Western blot鉴定具有很好的抗原性。总之，SUMO表达系统可以作为一种高效的原核表达系统以获得可溶性好、纯度高的目的蛋白。

本研究利用pE-SUMO作为表达载体，该表达载体含有6×组氨酸标签和SUMO标签，这2种标签都可以增加目的蛋白的可溶性表达。另外，6×组氨酸蛋白可与镍柱结合，因此，可以利用亲和层析技术对融合表达的重组蛋白进行纯化。据报道，组氨酸融合标签由6个带有较强正电荷的碱性氨基酸组成，在SDS-PAGE电泳中移动速度降低，会造成分子质量比实际偏大[11]。本试验通过SDS-PAGE电泳检测发现，2个重组蛋白的分子质量确实比理论值偏大，这符合预期的结果。pE-SUMO载体上含有BsaⅠ限制性内切酶酶切位点，酶切位点在SUMO标签蛋白与目的蛋白之间，可以利用SUMO蛋白酶实现N端无残留切割，从而得到纯净的目的蛋白。Western blot检测结果说明，表达得到的重组蛋白能够被抗O型FMDV的阳性血清识别，说明表达的重组蛋白具有很好的反应原性，可以用于后期的免疫试验。

目前，预防口蹄疫的主要措施是注射灭活疫苗，但灭活疫苗存在灭活不完全引起疫病暴发的危险，基因工程疫苗成为研究的热点。由于VP1蛋白主要暴露在FMDV病毒颗粒的表面，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，因此，FMDV基因工程疫苗主要是以VP1蛋白为研究热点[12-13]。据报道称，VP1结构蛋白不能单独形成病毒样颗粒，需要将FMDV的VP0、VP1和VP3三种蛋白质共表达，在合适的条件下装配才能够形成病毒样颗粒[14]。Guo等[15]用SUMO表达系统高效表达了可溶性的VP0、VP1和VP3重组蛋白，并用SUMO蛋白酶将SUMO标签切除，在合适的条件下发现，VP0、VP1和VP3三种蛋白质能够自我组装形成病毒样颗粒，这种病毒样颗粒在形状和结构上与FMDV病毒颗粒一致。将这种病毒样颗粒与佐剂结合后免疫猪，通过病毒中和试验能够检测到中和性抗体，通过T细胞增殖试验和对γ干扰素的检测发现，病毒样颗粒能够使机体产生很好的免疫效果。本研究利用SUMO表达载体高效表达FMDV的VP0和VP1结构蛋白，并通过对多种表达条件的优化，获得了这2种结构蛋白最佳的诱导表达条件，并且用抗FMDV的阳性血清检测发现，表达的重组蛋白有很好的反应原性。本研究为FMDV病毒样颗粒的进一步研究奠定了基础，同时也为FMDV基因工程亚单位疫苗的研究提供了理论指导和技术支持。

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Soluble Expression and Immuneoreactivity Analysis of FMDV VP0 and VP1 Protein

ZHAO Baolei1,LIU Yunchao2,CHEN Yumei2,JI Pengchao2,WANG Jucai1,LIU Chang2,YANG Suzhen2,ZHANG Gaiping1,2*

(1.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural Universitey,Zhengzhou 450002,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To obtain efficient soluble expressive VP0 and VP1 protein of O-type foot-and-mouth disease virus (FMDV).We optimizedVP0 andVP1 gene according to the preference codon usage ofE.Coli.The FMDV structural proteinVP0 andVP1 genes were synthesized and cloned into pE-SUMO vector.These two recombinant plasmids,SUMO-VP0 and SUMO-VP1 were transformed intoE.coliBL21(DE3) competent cells.Through optimizing the inducing temperature,time and the concentration of IPTG,we got that the optimized expression conditions of SUMO-VP1 was induced by 0.1 mmol/L IPTG,and induced at 20 ℃ for 8 h .The best inducing conditions of SUMO-VP0 was induced by 0.1 mmol/L IPTG,and expressed 12 h at 37 ℃.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the soluble protein could be identified by standard positive serum of FMDV,which confirmed that the fusion protein had good responsiveness.

FMDV; structural protein VP0 and VP1; soluble protein expression; SUMO tag

2016-09-06

国家重点研发计划项目(2016YFD0500704)；河南省基础与前沿技术研究计划项目(152300410238)；河南省科技创新基础前瞻类项目(20141644)；河南省重大科技专项(141100110100)

赵宝磊(1990-)，男，河南许昌人，在读硕士研究生，研究方向：动物疫病与疫苗。E-mail:baoleizhao2010@163.com

*通讯作者：张改平(1960-)，男，河南内黄人，研究员，博士，主要从事动物疫病免疫机制与疫苗研究。 E-mail:zhanggaiping2003@163.com

S855.3

A

1004-3268(2017)02-0105-06