延髓头端腹外侧部在脑梗死合并心律失常中的作用

贾淑伟+王玲+焦润生

[摘要] 目的 探讨延髓头端腹外侧部在脑梗死合并心律失常中的作用及可能机制。 方法 112只Wistar大鼠随机分为3组：对照组（n=16）、假手术组（n=16）和模型组（n=80）。模型组再随机分为造模后30 min、1 h、2 h、4 h 和8 h组，每组16只，观察脑梗死后延髓头端腹外侧部神经元活动的变化。另40只大鼠随机分为5组：对照组（n=8）、生理盐水组（10 μL，n=8）、L-谷氨酸组（0.5 μmol，10 μL，n=8）、谷氨酸非选择性NMDA受体拮抗剂MK-801（4 nmol，10 μL）加L-谷氨酸组（n=8）和MK-801加模型组（n=8），以观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用。心电图用生物信号采集系统采集。脑梗死动物模型制作采用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO），给药途径为侧脑室注射，以Fos蛋白作为神经元激活的标志物。 结果 对照组和假手术组大鼠心电图均无明显异常，模型组大鼠心律失常的发生率为78.75%（63/80），明显高于对照组（P < 0.01），且在心律失常发生的相应时间点延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达明显增加（P < 0.01）。侧脑室注射生理盐水组心电图无明显异常，侧脑室注射L-谷氨酸后心律失常发生率为87.5%（7/8），明显高于生理盐水组（P < 0.01），心律失常类型类似于模型组，同时延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达明显增高（P < 0.05）。MK-801预处理后再造模和MK-801预处理后再侧脑室注射L-谷氨酸组，均无心律失常发生，延髓头端腹外侧部Fos蛋白表达无显著性变化（P > 0.05）。 结论 脑梗死合并心律失常的发生与延髓头端腹外侧部活动增强有关，且此作用由谷氨酸激活NMDA受体介导。

[关键词] 延髓头端腹外侧部；脑梗死；心律失常；谷氨酸；NMDA受体

[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0011-05

脑梗死合并心律失常是脑梗死猝死的主要原因之一[1]。大量研究表明，脑自主神经功能失衡，特别是交感神经过度激活可致心律失常的发生[2]。合并心律失常的脑梗死患者存在着交感和副交感神经活动失衡[3-4]，但特异性的心电图異常与局部颅内病变之间的对应关系尚未建立。延髓头端腹外侧部（rostral ventrolateral medulla，RVLM）是脑内控制自主神经功能和心血管活动的关键脑区，本研究观察了RVLM活动变化在脑梗死合并心律失常中的作用及可能机制，以期为临床治疗提供理论依据，并丰富心血管功能活动调节的中枢机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠，体重（230±20）g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK（黑）2013-001，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2013-002。

1.2 药物与试剂

c-Fos多克隆抗体（sc-52，Santa Cruz）、AP标记的山羊抗兔二抗（zb-2308）和AP标记的马抗小鼠二抗（zd-2310）均购自中杉金桥公司。GAPDH单克隆抗体（小鼠）购自碧云天生物技术研究所。TTC购自中国医药上海化学试剂公司。

1.3 仪器

大鼠脑立体定位仪SN-3，日本Narishige；显微图像采集系统，日本Olympus；石蜡切片机RM2016，德国徕卡；凝胶成像系统，美国Alpha；RM6240B生物信号采集系统，中国成都泰盟。

1.4 实验分组

所有大鼠监测心电20 min，心电图正常者用于实验。为了观察脑梗死后RVLM神经元活动的变化，112只大鼠随机分为3组：对照组（n=16）、假手术组（n=16）和模型组（n=80）。模型组再随机分为造模后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h组，每组16只。对照组和假手术组大鼠在麻醉后或假手术操作后2 h取材，模型组大鼠在造模后相应的时间点取材。用免疫组织化学技术和Western blot技术检测每只大鼠右侧脑（缺血侧）RVLM脑区Fos蛋白的表达。为了观察谷氨酸在脑梗死诱发心律失常中的作用，40只大鼠随机分为5组，每组8只：对照组、生理盐水组（10 μL）、L-谷氨酸组（0.5 μmol，10 μL）、MK-801（4 nmol，10 μL）后20 min再L-谷氨酸组和MK-801（4 nmol，10 μL）后20 min再造模组。所有大鼠在侧脑室注射后或术后30 min取材。用Western blot技术检测每只大鼠右侧脑RVLM脑区Fos蛋白表达。

1.5 脑缺血动物模型制备

水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉。栓线经颈总动脉、颈内动脉插入大脑中动脉，进线长度距颈总动脉分叉（17.5 ± 0.5）mm[5]。假手术组栓线到大脑中动脉起始处后立即撤回，其余操作与模型组相同。

1.6 模型鉴定

神经功能学评分大于2分且TTC染色梗死区明显者计入模型组。

1.6.1 神经功能学评分 神经功能学评分值为0～4分，其中，没有神经功能缺陷计0分；前肢屈曲计1分；对侧前肢轻度抓爪计2分；让大鼠自由活动，拉其尾巴后大鼠向轻瘫侧绕圈行走计3分；如果大鼠未受任何刺激自发向轻瘫侧绕圈行走计4分[6-8]。

1.6.2 TTC染色 将大鼠脑做2 mm厚的连续冠状切片，置于2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）生理盐水溶液中，37℃孵育15 min。红色染色区为正常脑组织，白色未染色区为梗死区。

1.7 免疫组化检测

大鼠灌注固定后将含RVLM的脑组织块石蜡包埋，冠状切片（5 μm），水化，修复抗原，10% H2O2灭活内源性过氧化物后5% BSA封闭，兔来源的Fos抗体（1∶200）4℃孵育过夜，PBS洗3次，二抗（1∶500）37℃孵育30 min，DAB避光染色5 min，水冲，苏木精染色30 s，水冲，再次脱水、透明，中性树胶封片，显微镜下观察计数。Fos表达阳性神经元的核呈黄棕色染色，在高倍镜（400×）下分别计数5个区域阳性神经元数，然后取平均值。

1.8 Western blot检测

脑组织加入组织裂解液（RIPA∶PMSF为100∶1）研磨，4℃ 1000 r/min离心15 min得到匀浆液，取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后将蛋白转到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，3%牛血清白蛋白37℃封闭1 h，TBST洗膜，孵一抗（1∶500）4℃过夜，TBST洗膜，孵二抗（1∶1000）37℃ 1 h，TBST洗膜，BCIP/NBT显色。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。结果用Alphaview 3.1.1.0软件分析。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MCAO大鼠心电图变化

对照组和假手术组大鼠无心律失常发生，模型组大鼠心律失常的发生率高达78.75%（63/80），明显高于对照组（P < 0.01），与临床报道一致[1]，但心律失常的发生率偏高，可能与实验动物模型脑缺血程度相对均一，而脑梗死患者的损伤程度不可能均一有关。MCAO后大鼠會出现2次心律失常，分别在MCAO后（15.63±1.58）min，持续（31.02±1.85）min；（238.36±14.32）min，持续（26.28±1.36）min。心律失常类型主要是室性期前收缩（室性二联律）和室性快速性心律失常。侧脑室注射生理盐水组心电图无明显异常，侧脑室注射L-谷氨酸后心律失常发生率为87.5%（7/8），明显高于生理盐水组（P < 0.01），心律失常类型类似于模型组大鼠。侧脑室注射谷氨酸非选择性NMDA受体拮抗剂MK-801后的20 min内未见心律失常的发生，20 min后行MCAO和20 min后侧脑室注射L-谷氨酸都未见心律失常的发生，提示脑梗死能诱发心律失常，且与谷氨酸作用于NMDA受体的有关。

2.2 MCAO后RVLM内Fos蛋白表达免疫组化结果

笔者先期进行室旁核[8]研究时，分别观察了MCAO后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和16 h室旁核活动的改变与心律失常发生的关系，发现对照组和假手术组之间差异无统计学意义（P > 0.05）；室旁核的活动从15 min开始增强，持续到30 min时达峰值，认为30 min的增强是15 min的延续；16 h后室旁核的活动改变差异无统计学意义（P > 0.05）。故本研究只观察了MCAO后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h RVLM活动的改变，发现在对照组，RVLM内只可见极少量淡染的阳性神经元；在模型组，RVLM内阳性神经元数量明显增加且染色加深，与对照组比较，MCAO后30 min和4 h RVLM内神经元Fos阳性表达的增加，且差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2（封四）。

2.3 MCAO后RVLM内Fos蛋白表达Western blot结果

与对照组比较，MCAO后RVLM神经元Fos蛋白表达在30 min和4 h明显增加（P < 0.01）（图3），与免疫组化结果一致，表明MCAO后RVLM神经元被激活了两次，分别在30 min和4 h左右，与MCAO后心律失常发生时间点相对应，说明MCAO后心律失常的发生与RVLM激活有关。

2.4 RVLM内Fos蛋白表达的谷氨酸能机制

与对照组比较，侧脑室注射生理盐水后RVLM内Fos蛋白表达无明显变化（P > 0.05），侧脑室注射L-谷氨酸后RVLM内Fos蛋白的表达明显增加（P < 0.05），侧脑室注射MK-801可阻断侧脑室注射L-谷氨酸（P > 0.05）和MCAO（P > 0.05）引起的Fos蛋白表达的增加（图4）。提示脑梗死后RVLM的激活由脑内高水平的谷氨酸作用于NMDA受体所介导。

A：对照、侧脑室注射生理盐水（10 μL）、侧脑室注射L-谷氨酸（0.5 μmol，10 μL）以及MK-801（4 nmol，10 μL）预处理后给予谷氨酸和MCAO后RVLM内Fos蛋白表达的Western blot条带；B：上述不同条件下RVLM内Fos蛋白表达变化的统计图，与对照组比较，*P < 0.05

和MCAO后RVLM内Fos蛋白表达的Western blot结果

3 讨论

脑梗死早期合并心律失常患者，起病急，变化快，不能用脑疝来解释[9]，许多合并心律失常的脑梗死患者并无原发心脏病史[10]，提示脑梗死合并心律失常的发生源于中枢神经系统。脑自主神经功能失衡，特别是交感神经过度激活可诱导致命性心律失常的发生[2]，而且合并心律失常的脑梗死患者确实存在交感和副交感神经活动失衡[3]。有研究发现，电或化学刺激RVLM，可使交感神经兴奋性增加，心率加快，血压上升和诱发心电异常，而损毁两侧RVLM，可使交感神经兴奋性降低和交感节律消失，血压降到神经节阻断和脊椎动物水平[11-12]，可见RVLM是脊髓以上中枢调控交感神经输出的重要通路，是中枢调控心血管活动的重要脑区之一，且可因其活动增强使交感神经过度激活而诱发心电异常。本研究发现MCAO后，78.75%出现心律失常的大鼠RVLM活动增强，提示脑梗死后心律失常的发生与RVLM活动增强导致的交感神神经过度兴奋有关。

RVLM内可见谷氨酸免疫阳性结构[13-15]，刺激RVLM组织切片上的多数交感节前神经元所产生的快兴奋性突触后电位可被谷氨酸受体阻断药消除[16]，RVLM内微量注射谷氨酸能引起血压升高和心率加快，刺激丘脑下部所引起的心血管效应，能被RVLM内注射谷氨酸受体阻断药阻断[17]。形态学证实，RVLM内既存在内源性谷氨酸能神经元，也存在外源性的谷氨酸能神经传入。前者可投射到脊髓中间外侧柱的交感节前神经元，兴奋交感神经[18]，是延髓到交感节前神经元的所有兴奋性传出的关键部位；后者可能来自孤束核、室旁核（paraventricular nucleus，PVN）等中枢核团的纤维投射，这些投射到RVLM的谷氨酸能神经元可通过NMDA受体介导交感紧张性兴奋[19]。本研究发现，侧脑室注射L-谷氨酸后，RVLM被激活，此激活可被NMDA受体拮抗剂MK-801阻断，且MK-801也能阻断MCAO后RVLM的激活。这些结果提示脑梗死后脑内异常增高的谷氨酸可能通过作用于NMDA受体使RVLM激活，进而激活脊髓中间外侧柱交感节前神经元，使交感神经输出增加，诱发心律失常。解剖学研究发现，猫的PVN存在向RVLM的纤维投射，电刺激PVN细胞可顺行激活RVLM，损毁双侧RVLM几乎去除电刺激PVN引起的增压反应，表明RVLM介导PVN的增压反应，RVLM神经元是PVN下行交感兴奋通路的一部分，构成的PVN-RVLM-脊髓通路在交感神经系统和心血管活动的调节中起着重要作用[14-15]。Yang等[20]研究发现，刺激PVN可使心率增加、肾交感神经兴奋，RVLM内注射谷氨酸也能使心率增加、肾交感神经兴奋，若是在刺激PVN的同时给予谷氨酸受体拮抗剂犬尿烯酸，上述现象不再出现。说明从PVN到RVLM的突触中谷氨酸是作为兴奋性神经递质而起作用。笔者前期研究发现，MCAO后PVN活动增高[8]，提示脑梗死后RVLM活动的增强也可能是脑内高浓度的谷氨酸使PVN活动增强的结果，进而使交感神经的输出增加，诱发心律失常。

总之，脑梗死合并心律失常的发生与脑梗死后RVLM活动增强有关，且此作用由谷氨酸激活NMDA受体所介导。

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（收稿日期：2016-06-13 本文编辑：程 铭）