镉污染和接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响

刘芳，景戍旋，胡健，肖燕*，张英俊

(1.南京农业大学草业学院，江苏 南京210095；2.中国农业大学草业科学系，北京100193)

镉污染和接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响

刘芳1，景戍旋1，胡健1，肖燕1*，张英俊2

(1.南京农业大学草业学院，江苏 南京210095；2.中国农业大学草业科学系，北京100193)

采用盆栽试验研究在3个镉污染(0,6和12 mg Cd/kg)水平下，接种5种丛枝菌根真菌[分别接种聚丛球囊Glomusaggregatum(Ga)、幼套球囊霉G.etunicatum(Ge)、扭形球囊霉G.tortuosum(Gt)、根内球囊霉G.intraradices(Gi)和地表球囊霉G.versiforme(Gv)，以不接种为对照]对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响。结果表明：与不加镉(0 mg Cd/kg)处理相比，接种Ga、Gi 和Gt菌种处理的紫花苜蓿菌根侵染率在12 mg Cd/kg条件下降低了33.90%、19.17%和31.95%；0 mg Cd/kg水平下接种Gt菌种紫花苜蓿总生物量分别比接种 Ga、Ge、Gi和Gv菌种处理显著高出33.19%、67.74%、57.29%和34.91%，但在12 mg Cd/kg水平时总生物量与以上菌种处理相比，分别降低16.67%、34.07%、32.96%和52.76%；在镉浓度为12 mg Cd/kg时，接种Gv菌种处理的紫花苜蓿株高、根瘤菌数量、地上生物量、总生物量、地上植株氮含量和整株含氮量与不接种处理相比，分别增加 65.41%、95.24%、61.87%、50.30%、5.83%和71.55%；随镉浓度增加接种Gv菌种处理紫花苜蓿土壤中铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)浓度显著下降。综上分析，在镉污染条件下，接种Gv菌种能促进紫花苜蓿生长和氮吸收；当土壤镉浓度超过6 mg Cd/kg时，接种Gt菌种不利于紫花苜蓿的生长。

紫花苜蓿；丛菌根真菌；镉；氮吸收

土壤重金属污染具有长期性、隐蔽性和不可逆性，不仅导致土壤肥力与作物产量、品质下降，还易引发地下水污染问题，并通过食物链在植物、动物和人体内累积。镉(cadmium，Cd)是毒性最强的重金属元素之一，能够影响植物的生长和对营养元素的吸收，从而影响重金属污染土壤植被的恢复[1-2]。

丛枝菌根真菌(AMF)能与80%的陆地植物形成共生体，在植物-土壤系统中具有重要的功能[3]。AMF根外菌丝具有阳离子交换能力，不仅能直接固定重金属，减轻植物根系对重金属元素的吸收，而且即使重金属随着菌丝进入根系内，共生表面也能阻止重金属进入根细胞[4]。AMF的分泌物球囊霉素能够与镉结合并对其进行固定[5]。AMF根外菌丝扩展了植物吸收营养元素的表面积，促进宿主植物对营养(N、P等)的吸收，促进植物的生长，生物量的增加降低了植株重金属的浓度，造成“稀释效应”，从而减轻重金属的毒害[6]。因此，AMF能提高宿主植物对重金属胁迫的耐受性[7-10]。但是也有研究表明：接种AMF不能够提高宿主植物对重金属胁迫的抵抗能力[11-12]。由于土壤环境的不一致，不同的AMF-植物共生体在形态、营养吸收、共生效率等方面表现出很大的差异性[13]。因此，根据环境条件选择合适AMF-植物共生体对宿主植物克服不利环境(如养分贫瘠、盐分胁迫、重金属污染等)非常重要[14]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有生长快、生物量大和对不良环境适应性强等特性[15]，是世界各国广泛种植的优良豆科牧草，应用前景非常广阔。紫花苜蓿对重金属有一定的耐受性，可以吸收土壤中的重金属，因此紫花苜蓿被作为一种理想的作物来修复被镉污染的土地。植物本身的营养物质在耐镉胁迫过程中起到非常重要的作用，有研究表明接种AMF可以促进植物生长，而国内外有关在一定镉污染条件下接种AMF对紫花苜蓿生长的影响的研究报道相对较少[16]。AMF是否在镉污染条件下依然能促进紫花苜蓿生长，提高其对重金属的耐受性？本研究以紫花苜蓿为宿主植物，通过接种5种不同AMF菌剂，比较不同镉污染水平下紫花苜蓿的生长和氮吸收规律，为评价重金属污染土壤中AMF菌根效应提供理论依据，同时探求接种不同AMF菌种对紫花苜蓿短期内吸收无机氮的异同。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验土壤取自南京农业大学牌楼实验基地，供试土壤pH 7.56，电导率0.77 ms/cm，总有机碳8.03 g/kg，总氮0.6 g/kg，总磷0.28 g/kg，总钾1.72 g/kg，总镉0.0007 mg/kg。供试紫花苜蓿，品种为百绿公司紫花苜蓿品种“三得利”，带包衣，秋眠级别为6级。

试验菌种购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库”(BGC)。5种AMF分别为聚丛球囊霉Glomusaggregatum(Ga)、幼套球囊霉G.etunicatum(Ge)、扭形球囊霉G.tortuosum(Gt)、根内球囊霉G.intraradices(Gi)、地表球囊霉G.versiforme(Gv)。 BGC 编号分别为BGC BJ06、BGC HEN02A、BGC NM03A、BGC BJ09 和 BGC GD01C。国家微生物资源平台编号分别为1511C0001BGCAM0005、1511C0001BGCAM0028、1511C0001BGCAM0001、1511C0001BGCAM0042和1511C0001BGCAM0031。该供试菌种由北京市农林科学院以高粱(Sorghumbicolor)为宿主，利用菌剂扩繁培养而成。

1.2 试验设计

采取双因素析因试验设计，试验因素为镉和AMF。施Cd有3个水平：0,6和12 mg Cd/kg，AMF包括6个水平：不接种、分别接种Ga、Ge、Gt、Gi和Gv，共18个处理，每个处理5个重复，共90盆。

试验于2014年11月- 2015年3月在南京农业大学牌楼教学科研基地(光华路139号)温室内进行，采用盆栽试验。土壤过2 mm筛后与河沙以2∶1(w/w)比例混合，混合基质在120 ℃下高温高压蒸汽灭菌2 h，以消除土壤中的真菌孢子。每盆基质干重500 g，镉添加以CdCl2水溶液的形式与土壤充分混合。接种处理：每盆加菌剂15 g，不接种处理为对照。种子长出真叶后间苗，每盆中保留长势相近的紫花苜蓿植株8 株，定期以去离子水平衡水分。在2015年1月13日紫花苜蓿幼苗期以NH4Cl的形式一次性施入200 mg N/kg以促进生长。

1.3 菌根侵染率、紫花苜蓿生物量以及氮素含量的测定

紫花苜蓿生长8周后测定株高，并分地上和地下两部分收获。收获时记录植株根系上的有效根瘤(米粒大小的粉色根瘤)数量。取新鲜根样，剪成1 cm根段，随机取出部分根样用曲利苯蓝-直线截获法测定根系侵染率，并在显微镜下观察丛枝菌根侵染状况，用十字交叉法计算菌根侵染率[17-18]。紫花苜蓿地上和地下部分在120 ℃杀青2 h，65 ℃烘干48 h至恒重，测定地上地下干重和紫花苜蓿总生物量。样品烘干后磨碎过孔径为0.074 mm筛，用凯氏定氮法测紫花苜蓿含氮量。地上部和地下部紫花苜蓿的吸氮量及苜蓿根冠比用下列公式计算：

紫花苜蓿吸氮量(mg/pot)=CN×MP

式中，CN为紫花苜蓿含氮量(mg/g)；MP为紫花苜蓿生物量(g/pot)。

根冠比=植株根系生物量/植株地上部生物量

土壤硝态氮用氯化钾(2 mol/L)浸提-双波长紫外分光光度法测定，土壤铵态氮用氯化钾(2 mol/L)浸提-靛酚蓝比色法测定，土壤pH以水土比5∶1(v/w)在120 r/min摇床上摇动30 min静置后测定，理化性质具体实验方法参考土壤农化分析[19]。

1.4 统计分析

用SPSS 13.0软件进行双因素方差分析和5%水平下LSD多重比较检验各处理平均值之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿根侵染率的影响

在镉浓度为0 mg/kg土壤中，接种Gi菌种处理紫花苜蓿菌根侵染率最高(100%)，随后依次为接种Ga，Gt，Ge和Gv菌种处理，但是在镉浓度为12 mg Cd/kg土壤中，接种Gv菌种处理紫花苜蓿菌根侵染率最高(83.33%)，随后依次为接种Gi，Ge，Gt和 Ga菌种处理。与镉浓度为0 mg Cd/kg处理相比，12 mg Cd/kg条件下接种Ga，Gi和Gt菌种处理的紫花苜蓿菌根侵染率显著下降了33.90%，19.17%和31.95%(图1)。双因素方差分析结果显示接种不同AMF对紫花苜蓿菌根侵染率影响不显著，接种AMF和Cd之间交互作用显著(表1)。

2.2 接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿株高和地上地下生物量的影响

在镉浓度为0 mg Cd/kg处理下，接种Gt和Gv菌种与不接种处理相比都显著增加了紫花苜蓿的株高。而在6和12 mg Cd/kg处理下，接种Gv菌种与接种其他菌种处理相比，显著增加了紫花苜蓿的株高。在镉浓度为0 mg Cd/kg处理下， 接种Gt菌种处理的紫花苜蓿株高最高， 但是在6和12 mg Cd/kg条件下株高显著下降了52.16%和50.92%(图2A)。接种AMF 和Cd污染对紫花苜蓿株高的交互作用显著(表1)。在镉浓度为0和12 mg Cd/kg条件下，与不接种AMF相比，只有接种Gv菌种处理显著增加了紫花苜蓿根瘤菌的数量。然而，在镉浓度为6和12 mg Cd/kg条件下，接种Gt菌种显著降低了紫花苜蓿根瘤菌的数量(图2B)。接种AMF和Cd对紫花苜蓿根瘤菌的数量交互作用不显著。在镉浓度为0 mg Cd/kg条件下，紫花苜蓿地上部分生物量接种不同AMF处理之间差异不显著(图2C)。与不接种处理相比，接种Gv菌种显著增加了镉浓度为6和12 mg Cd/kg处理的紫花苜蓿地上部分的生物量。AMF和Cd对紫花苜蓿地上部分生物量，地下部分生物量和总生物量交互作用显著。然而，在镉浓度为6和12 mg Cd/kg条件下，接种不同AMF处理之间差异不显著。在镉污染条件下，接种不同AMF处理之间紫花苜蓿地下部分生物量差异不显著。然而，在镉浓度为0 mg Cd/kg处理下，接种Gt菌种处理的紫花苜蓿地下部分和总生物量显著高于其他菌种处理。在镉浓度为6 mg Cd/kg处理下，接种Gv菌种处理的紫花苜蓿总生物量最大，然后依次为接种Ge、Gt、Ga、CK和Gi菌种处理。在镉浓度12 mg Cd/kg土壤中，紫花苜蓿总生物量的最大值和最小值分别出现在接种Gv和Gt菌种处理(图2D，F)。在镉浓度为0和6 mg Cd/kg条件下，接种Gt菌种显著增加了紫花苜蓿根冠比。随着镉污染程度的增大，紫花苜蓿根冠比有下降趋势(图2E)。

表1 不同镉水平和接种丛枝菌根真菌对苜蓿各指标影响的双因素方差分析Table 1 The significant level of two-way ANOVA for the parameters between Cd levels and mycorrhizal inoculation

图2 不同镉水平和接种菌根真菌对紫花苜蓿生长的影响(平均值±标准误，n=4)Fig.2 Effects of Cd levels and mycorrhizal inoculation on growth of M. sativa (means±SE, n=4)

图3 不同镉水平和接种菌根真菌对紫花苜蓿氮吸收的影响(平均值±标准误，n=4)Fig.3 Effects of Cd levels and mycorrhizal inoculation on N nutrients of M. sativa (means±SE, n=4)

2.3 接种丛枝菌根真菌对苜蓿地上地下含氮量的影响

在所有镉水平下，接种Gv处理的紫花苜蓿地上部分氮含量都高于接种Gt菌种处理(图3A)。与不接种AMF处理相比，所有镉水平下接种Gv菌种处理显著增加了紫花苜蓿地上部分的吸氮量。镉浓度为6和12 mg Cd/kg显著降低了接种Gt和Ga菌种处理的紫花苜蓿地上部分和全株的吸氮量(图3C，E)。在镉浓度为0和6 mg Cd/kg条件下接种Gv和Gt菌种处理的紫花苜蓿地下部分氮含量差异显著(图3B)。在镉浓度为12 mg Cd/kg条件下，紫花苜蓿地下部分的吸氮量最大值出现在接种Gv菌种处理(图3D)。接种AMF和Cd对紫花苜蓿地上部分和地下部分的氮含量交互作用显著(表1)。

2.4 接种丛枝菌根真菌对土壤无机氮的影响

与不接种AMF菌种处理相比，接种Gt和Gv菌种显著增加了土壤NH4+-N浓度。在镉浓度为12 mg Cd/kg处理中，除了接种Ga菌种处理NH4+-N浓度显著下降外，各接种处理NH4+-N浓度没有显著差异。各接种处理在镉浓度为12 mg Cd/kg时土壤铵态氮浓度都下降。不添加镉处理中，只有接种Ga菌种处理降低了硝态氮浓度。随着镉浓度的增加，接种Ge、Gi、Gt和Gv菌种处理的NO3--N浓度下降(图4A，B)。在镉浓度为0和12 mg Cd/kg条件下，接种Gt和Gv 菌种处理NO2--N浓度下降。所有镉水平下，接种Gt和Gv菌种处理与未接种相比，pH值都显著增加(图4D)。接种AMF和Cd 对土壤NH4+-N，NO3--N和NO2--N浓度交互作用不显著(表1)。

图4 镉水平和接种菌根真菌对紫花苜蓿土壤无机氮浓度和pH值的影响(平均值±标准误，n=4)Fig.4 Effects of Cd levels and mycorrhizal inoculation on inorganic N concentration and pH of substrates (means±SE, n=4)

3 讨论

接种不同的AMF菌种能改变宿主植物耐受重金属胁迫的能力[20]。丛枝菌根真菌-宿主植物的共生效率取决于重金属浓度、土壤理化性质以及宿主植物和AMF的种类[21]。菌根的状态与环境因素，尤其是土壤重金属的水平相关[22-23]。本研究中，没有镉污染条件下，接种Ga和Gi菌种处理的紫花苜蓿菌根侵染率(98.33%，100%)显著高于接种Ge和Gv菌种处理(90.91%，90.83%)。然而，在镉浓度为12 mg Cd/kg条件下，接种Ga，Gi和Gt处理的紫花苜蓿菌根侵染率显著下降了33.33%、19.17%和30.91%。镉污染程度的增加没有影响接种Ge和Gv菌种处理的菌根侵染率。因此，在镉浓度为12 mg Cd/kg处理下，接种Ge，Gi 和Gv菌种处理拥有相对较高的菌根侵染率(图1)。前人研究表明：当有机物污染程度增加时，接种G.etunicatum的紫花苜蓿菌根侵染率下降[24]，接种G.mosseae的紫花苜蓿在环境盐浓度增加时菌根侵染率也会下降[25]，重金属会影响孢子密度、根外菌丝的形成和菌根侵染率[22,26-28]。另一方面，也有许多文献报道了重金属污染对菌根侵染率没有影响或者有促进作用[12,16,29-30]，这可能归因于重金属浓度增加后根系分泌物的下降和磷的沉淀[31]。

AMF对非镉污染条件下紫花苜蓿的地下部分生物量没有显著影响(图2D)。然而，接种Gt菌种时由于根系生物量的增加，总生物量和根冠比显著高于其他菌种处理。接种Gt菌种处理下，非镉污染条件下总生物量最高，而镉浓度为12 mg Cd/kg处理下总生物量最低(图2F)。以往研究表明玉米(Zeamays) 和水稻(Oryzasativa) 接种菌根真菌后重金属污染反而降低了生物量[12,32]。AMF能够通过菌丝网络固定重金属，从而减少重金属从地下部分向地上部分的运输[7-8]。另外，AMF分泌的球囊霉素，也能起到固定重金属的作用[33]。同样以紫花苜蓿为宿主，不同AMF种类菌丝网络的范围、密度和分泌球囊霉素的能力也不同[34]。前人研究指出，接种AMF促进植物的生长，这与接种后植物重金属浓度降低有关[16,35]。本研究中，接种Gv菌种地上和总生物量增加，显示接种Gv菌种能够促进紫花苜蓿在镉污染条件下的生长能力。在试验中3个镉水平，接种Gv菌种处理的根瘤菌数量、地上部分和全株的吸氮量都最高(图2B，图3C，E)。豆科植物丛枝菌根真菌-根瘤菌-植物协同作用能促进根瘤化过程并增强植物固氮能力[36-39]。接种Gv菌种处理下AMF促进根瘤菌的形成可能是造成此处理下紫花苜蓿含氮量高的原因之一。

前人研究表明，随着重金属浓度的增加，土壤NH4+-N浓度升高[30]。而本研究中接种Gv菌种处理下，土壤NH4+-N和NO3--N浓度降低(图4A，B)，轻度重金属污染可能会促进植物对无机氮的吸收。前人研究报道接种AMF能够减少土壤中无机氮的含量[40-41]。但是本研究中在镉浓度为12 mg Cd/kg污染条件下，只有接种Ga菌种处理土壤中NH4+-N和NO3--N 浓度都显著降低(图4A，B)，表明在养分亏缺的情况下，接种Ga菌种促进紫花苜蓿短期内对无机氮吸收的能力较强。根际土壤pH的增加能降低重金属的有效态从而降低植物对重金属的吸收[42]。在试验的3个镉水平下，接种Gt和Gv菌种显著增加了土壤pH值，有利于促进重金属的稳定并保护宿主植物抵抗重金属胁迫。

4 结论

在镉浓度为12 mg Cd/kg 条件下，接种Gv菌种显著增加了紫花苜蓿的株高、根瘤菌数量、地上部分生物量，总生物量，地上部分和全株吸氮量。随着镉浓度的增加，接种Gv菌种处理土壤NH4+-N和NO3--N的浓度显著下降。以上结果表明接种Gv菌种能够增加紫花苜蓿在镉污染条件下的生长和氮吸收。尽管接种Gt菌种在非镉污染条件下生物量最大，但是当镉浓度增加到12 mg Cd/kg 时，根瘤菌、地上部分和总生物量、地上部分和全株吸氮量显著下降，说明在镉污染下接种Gt菌种会抑制紫花苜蓿的生长和氮吸收。一旦土壤氮水平增加，接种Ga菌种有利于增加紫花苜蓿短期内对无机氮的吸收能力。继续研究不同氮水平下不同生长阶段接种菌根真菌对宿主植物无机氮吸收的影响的规律，可对AMF-宿主植物共生体吸收营养元素的动态有更深入的了解。

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Effects of cadmium and arbuscular mycorrhizal fungi inoculation on the growth and nitrogen uptake of alfalfa (Medicagosativa)

LIU Fang1, JING Shu-Xuan1, HU Jian1, XIAO Yan1*, ZHANG Ying-Jun2

1.CollegeofAgro-grasslandScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.DepartmentofGrasslandScience,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China

A pot experiment in a greenhouse was conducted to investigate the growth and nitrogen (N) uptake ofMedicagosativainoculated with different arbuscular mycorrhizal fungi [Glomusaggregatum(Ga),Glomusetunicatum(Ge),Glomusintraradices(Gi),Glomustortuosum(Gt),Glomusversiforme(Gv)] or un-inoculated in soil without or with cadmium at two concentrations (6 and 12 mg Cd/kg). Mycorrhizal colonization of alfalfa inoculated with Ga, Gi, and Gt was 33.90%, 19.17%, and 31.95% lower, respectively, in 12 mg Cd/kg soil than in 0 mg Cd/kg soil. In soil without Cd, the biomass of the Gt-inoculated plants was 33.19%, 64.74%, 57.29%, and 34.91% higher than that in the Ga, Ge, Gi, and Gv treatments, respectively. In 12 mg Cd/kg soil, the biomass of the Gt-inoculated plants was 16.67%, 34.07%, 32.96%, and 52.76% lower than that of those inocluated with Ga, Ge, Gi, and Gv, respectively. Compared with uninoculated plants, those inoculated with Gv showed significantly increased shoot height, number of nodules, shoot biomass, total biomass, shoot N content, and total N content (by 65.41%, 95.24%, 61.87%, 50.30%, 5.83%, and 71.55%, respectively) in soil containing 12 mg Cd/kg. The NH4+-N and NO3--N concentrations in soil significantly decreased with increasing Cd levels in the Gv-inoculation treatments. These results showed that Gv inoculation promoted the growth and N uptake of alfalfa in Cd-contaminated soils, whereas Gt inoculation could not benefit the growth of alfalfa grown in soils containing more than 6 mg Cd/kg.

alfalfa; arbuscular mycorrhizal fungi; cadmium; nitrogen uptake

10.11686/cyxb2016133

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-29；改回日期：2016-06-28

中央高校基本科研业务专项资金(KYZ201554),国家自然科学基金(31501996)和江苏省自然科学基金(BK20150665)资助。

刘芳(1989-)，女，河南周口人，在读硕士。E-mail: 838245960@qq.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: xiaoyan@njau.edu.cn

刘芳， 景戍旋， 胡健， 肖燕， 张英俊. 镉污染和接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响. 草业学报, 2017, 26(2): 69-77.

LIU Fang, JING Shu-Xuan, HU Jian, XIAO Yan, ZHANG Ying-Jun. Effects of cadmium and arbuscular mycorrhizal fungi inoculation on the growth and nitrogen uptake of alfalfa (Medicagosativa). Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 69-77.