硫化氢对低氧性肺动脉高压大鼠P47phox表达的影响

单 芳 刘雨娟 曹玉青 孙应彪

(河西学院医学院生理学与病理生理学教研室，甘肃 张掖 734000)

硫化氢对低氧性肺动脉高压大鼠P47phox表达的影响

单 芳 刘雨娟 曹玉青1孙应彪2

(河西学院医学院生理学与病理生理学教研室，甘肃 张掖 734000)

目的 观察硫化氢H2S对低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠P47phox表达的影响。方法 36只体重(180±20)g健康成年雄性SD大鼠，随机分为常氧组、低氧组、低氧+硫氢化钠(NaHS)组，每组12只。低氧16 d后分别检测其平均肺动脉压(mPAP)、右心室肥厚情况和肺血管形态学指标的变化。采用Western印迹检测肺动脉组织P47phox的表达水平。结果 与常氧组比较，低氧组mPAP明显升高，右室/(左室+室间隔)比值显著增加(P<0.01)；部分肌型动脉百分比明显升高，非肌型动脉百分比明显降低(P<0.05)；肺动脉组织P47phox表达升高(P<0.05)。与低氧组比较，低氧+ NaHS组mPAP、右室/(左室+室间隔)比值均明显降低(P<0.01)；肺小血管中肌型动脉、部分肌型动脉百分比明显降低，非肌型动脉百分比明显升高(P<0.05)；肺动脉组织P47phox表达明显降低 (P<0.01)。结论 H2S可能通过抑制大鼠肺动脉组织P47phox表达而调节低氧性肺血管结构重建和HPH的形成。

硫化氢；肺动脉高压；低氧； P47phox

低氧性肺动脉高压(HPH)是慢性低氧性肺部疾病的一种常见并发症，其发生机制至今尚未阐明。肺动脉内皮损伤会导致肺动脉中膜平滑肌细胞增生、肥大和凋亡，细胞外基质增加，使肺血管结构重建，产生肺动脉高压。P47phox是产生活性氧的因子之一，其表达异常与肺动脉高压形成密切相关。硫化氢H2S 是新近发现的又一种新型气体信使分子，具有舒张血管、改善内皮损伤、阻止平滑肌细胞增殖的作用〔1〕。有关H2S对HPH 大鼠肺动脉组织P47phox表达的影响，目前国内外尚未见报道。因此，本文通过观察H2S对低氧大鼠肺血管结构重建相关指标及肺动脉组织P47phox 表达水平的变化，探讨H2S 在HPH 大鼠发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 健康成年雄性SD大鼠36只，体重(180±20)g，由兰州大学医学院实验动物中心提供。NaHS试剂购自杭州上虞京新药业有限公司；P47phox一抗，Santa Cruz Biotechnology；二抗，购自北京中山生物技术有限公司。

1.2 实验分组 36只大鼠随机分为3组：常氧组(n=12)；低氧组(n=12)，放入常压低氧舱内，每天间断给予缺氧6 h，连续16 d〔2〕；低氧+NaHS组(n=12)，操作同低氧组，只是每天腹腔注射1次NaHS (15 μmol/kg)，连续16 d。

1.3 大鼠肺动脉压力及右心室肥厚程度测定 于第17天，经腹腔注射1%戊巴妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，选择右侧颈动脉插管测定平均肺动脉压(mPAP)。摘取大鼠右室、左室和室间隔，称其湿重，计算右室/(左室+室间隔)比值，判断右心室肥厚情况。

1.4 肺血管形态学指标观察 切取右侧肺叶，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片(厚度4 μm/张)，常规制备病理切片，采用弹力纤维Schmorl染色法，400倍光镜观察并测定在肺小血管中肌型动脉(MA)、部分肌型动脉(PMA)及非肌型动脉(NMA)所占的比例。

1.5 肺中型动脉和小型动脉组织P47phox的表达 采用Western印迹测定肺中型动脉和小型动脉组织P47phox的蛋白表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠mPAP和右室/(左室+室间隔)比值的变化 表1可见，与常氧组比较，低氧组mPAP显著升高(P<0.01)，右室/(左室+室间隔)比值明显升高(P<0.01)；低氧+NaHS组mPAP及右室/(左室+室间隔)比值无明显变化(P>0.05)。与低氧组比较，低氧+NaHS组mPAP及右室/(左室+室间隔)比值明显降低 (P<0.01)。

2.2 大鼠肺小血管不同肌化程度的变化 表2可见，与常氧组比较，低氧组大鼠肺小血管MA、PMA百分比明显升高，而NMA百分比明显降低(P<0.05)，提示肺血管结构重建。与低氧组比较，低氧+NaHS组肺小血管中MA、PMA百分比明显降低，NMA百分比明显升高(P<0.05)，提示肺血管重建明显降低。

表1 各组大鼠mPAP、右室/(左室+室间隔) 比值比较

与常氧组比较：1)P<0.01；与低氧组比较：2)P<0.01，下表同

表2 各组大鼠肺小管不同肌化程度比较±s,n=12，%)

图1 各组大鼠肺MA和小型动脉中P47phox的表达

2.3 大鼠肺MA和小型动脉中P47phox的表达水平 图1可见，与常氧组(0.51±0.09)比较，低氧组肺MA和小型动脉组织中P47phox的蛋白表达水平明显升高(0.79±0.05，P<0.05)。与低氧组比较，低氧+NaHS组(0.61±0.08,P<0.01)肺MA和小型动脉组织中P47phox的蛋白表达水平则明显降低。

3 讨 论

缺氧所致的肺血管收缩和肺血管结构重塑，是HPH发生、发展和维持的形态基础，而HPH是慢性肺源性心脏病发病的中心环节〔3〕。本文结果说明低氧是形成HPH、右心室肥厚和肺血管重建的重要原因之一。

活性氧簇(ROS)的过度产生可引起肺动脉收缩反应和肺动脉结构重塑，在慢性缺氧性肺动脉高压的发生、发展中起重要作用〔4〕。NAD(P)H 氧化酶是中性粒细胞和血管内皮细胞中的ROS主要来源，在缺血性损害等过程中发挥重要作用。NAD(P)H氧化酶主要由5个亚基组成，包括2个膜亚基：gp91phox、p22phox和3 个胞质亚基：p47phox、p40pox、p67phox。当细胞受到相应刺激后,胞质亚基P47phox被磷酸化激活，与p67phox结合并向胞膜转位，与胞膜亚基结合组成有氧化活性的复合体，将氧催化为超氧自由基(-O2-)，进而产生一系列ROS，造成细胞损伤。本实验结果显示在低氧大鼠中P47phox表达增加，给予外源性H2S后，肺动脉内皮组织中P47phox表达减低，表明H2S对肺动脉内皮细胞损伤有保护作用。目前，有关H2S调节HPH的机制尚不清楚。

研究发现，给敲除P47phox 基因的大鼠血管平滑肌细胞和血管内皮细胞诱导，其ROS 的产生量明显减小〔5〕，同样用抗-P47phxo 抗体能抑制血管平滑肌细胞诱导的超氧阴离子的产生〔6〕。本文结果表明P47phox可能参与了低氧性肺动脉高压的形成。低氧可引起P47phox 发生磷酸化，导致ROS产生，而ROS直接参与对肺动脉内皮组织氧化损伤，导致肺动脉中膜平滑肌细胞增生、肥大和凋亡，细胞外基质增加，使肺血管结构重建，产生肺动脉高压。研究证实〔7〕，H2S可以增加NAD(P)H还原型与氧化型的比例，调节细胞的氧化还原状态，H2S可能使低氧中 NAD(P)H还原型增强，下调低氧中P47phox表达，减少ROS生成，从而保护肺动脉免受氧化损伤。也有研究表明H2S可以通过增加谷胱甘肽(GSH)来减少细胞的氧化应激损伤〔8〕。GSH能够清除人体内的自由基，作为体内一种重要的抗氧化剂，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基。

总之，H2S可能通过干扰 NAD(P)H 氧化酶生成通路的某些环节,降低P47phox 的表达水平，使ROS生成减少，从而有效地保护肺动脉内皮组织，减轻肺血管结构重建，抑制肺动脉高压形成。

1 Zhao WM,Zhang J,Lu Y,etal.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous kATP channel opener〔J〕.EMBO J,2001;20(21):6008-16.

2 薛全福,谢剑鸣,邵茂刚，等.常压缺氧性大鼠肺动脉高压模型的建立〔J〕.中华结核和呼吸杂志,1989;12(6):350-2.

3 Clini E，Cremona G，Campama M,etal.Production of endogenous nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease and patients with cor pulmonale:correlates with echo-doppler assessment〔J〕.Am J Respir Crit Care,Med，2000;162(2):444.

4 汤娜娜，刘先胜,徐永健，等.活性氧在慢性缺氧性肺动脉高压发病机制中的作用〔J〕.国际呼吸杂志,2008;28(5):318-20.

5 Takeya R,Ueno N,Sumimoto H,etal.Regulation of superoxide producing NADPH oxidases in nonphagocytic cells〔J〕.Methods Enzymol,2006;406(406):456-68.

6 Schieffer B,Luchtefeld M,Braun S,etal.Role of NAD(P)H oxidase inangiotensinⅡ-induced JAK/STAT signaling and cytokine induction〔J〕.Circ Res,2000;87(12):1195-201.

7 Deplancke B,Gaskins HR.Hydrogen Sulfide induces serum-independent cell cycle entry nontransformed rats intestinal epithelial cells〔J〕.FASEB J,2003;17(10):1310-2.

8 YuKa Kimura,Hideo Kimura.Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress〔J〕.FASEB J,2004;18(10):1165-76.

〔2015-09-25修回〕

(编辑 曹梦园)

刘雨娟(1982-)，女，硕士，副教授，主要从事细胞生物学研究。

单 芳(1973-)，女，实验师，主要从事机能实验学生理学教学研究。

R36

A

1005-9202(2017)03-0571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.020

1 河西学院医学院预防医学教研室

2 兰州大学公共卫生学院卫生毒理研究所