环氧合酶-2选择性抑制剂塞来昔布防治大鼠创伤性异位骨化的机制

曾荣东 柳明忠 陈巧凤 陈小青 许志通 张志珊 郑锦阳 连 涛

(福建医科大学附属泉州市第一医院骨科，福建 泉州 362000)

环氧合酶-2选择性抑制剂塞来昔布防治大鼠创伤性异位骨化的机制

曾荣东 柳明忠 陈巧凤 陈小青 许志通 张志珊1郑锦阳2连 涛3

(福建医科大学附属泉州市第一医院骨科，福建 泉州 362000)

目的 探究环氧合酶(Cox)-2选择性抑制剂塞来昔布对大鼠创伤性异位骨化的防治机制。方法 创伤性异位骨化大鼠予塞来昔布治疗，分别采取喂食2、6、10 w的不同方案，治疗后观察各组肢体的皮温、肿胀程度及X线表现，并通过实时定量PCR及Western印迹实验，检测跟腱组织骨形态发生蛋白(BMP)-4的表达含量。结果 塞来昔布组皮温、肿胀程度、新骨形成均显著低于对照(生理盐水处理)组(P<0.05)。同时，随着塞来昔布处理时间的延长，皮温均明显降低、肿胀程度及新骨形成情况均明显减轻；实时定量PCR及Western印迹检测显示：与对照组比较，塞来昔布组跟腱组织BMP-4的表达明显下调，并且随时间的延长，BMP-4的表达也相应下调。结论 塞来昔布可通过降低大鼠跟腱组织BMP-4的表达以干预异位骨化。

塞来昔布；异位骨化；骨形态发生蛋白(BMP)-4

异位骨化(HO)是一种非肿瘤性反应性病变，病理特征表现为局部纤维组织增生、钙化及化生，伴有异位新骨形成〔1〕，可导致该关节活动受限、强直、功能丧失。基因和自由基清除剂治疗还没有应用于临床，有待进一步的深入研究〔2〕。非甾体类抗炎药(NSAIDs)是目前临床公认的预防HO最有效的药物，但是约30%的患者因胃肠道反应而不能耐受〔3〕。有研究发现选择性环氧合酶 (Cox)-2抑制剂，如塞来昔布、美洛昔康等用于预防HO同样有效，且胃肠道反应小〔4〕。间充质细胞和骨形态发生蛋白(BMP)是诱导HO的主要活性介质〔5〕。林霖〔6〕直接注射骨形态发生蛋白(BMP)-4重组腺病毒在裸鼠肌肉内成功诱导HO，提示BMP-4与HO发生关系密切。本研究探讨COX-2选择性抑制剂预防大鼠HO的作用及使用疗程。

1 资料与方法

1.1 实验动物、试剂 60只SD级体重(100±10)g大鼠，雌雄各半，随机分为6组各10只，均购于上海斯莱克动物实验中心。塞来昔布(美国Gibco辉瑞公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒，蛋白裂解液，蛋白酶抑制剂(碧云天公司)，多克隆抗体(美国Santa公司)。

1.2 创伤性HO模型制备 大鼠以2%氯胺酮80～100 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于手术台上，手术区域脱毛，碘伏消毒手术部位，无菌手术刀片沿大鼠右跟腱纵行切开1 cm皮肤切口，显露跟腱止点，垂直切口方向横行切断近止点部跟腱，术后全层缝合切口。

1.3 治疗 术后第1天开始给药，塞来昔布各亚组予塞来昔布10 mg·kg-1·d-1喂食2、6、10 w，对照组各亚组喂食2 ml生理盐水2、6、10 w。各组均每天灌胃1次，术后第1周隔天观察1次，1 w后每周观察1次。

1.4 治疗结果评定 ①在术后第10周后观察各组肢体的皮温、肿胀程度，并在麻醉状态下摄右后肢侧位X 线片，观察新骨形成情况。皮温计平均值。肿胀程度：肿胀位于损伤点计1分，位于膝关节计2分，位于膝关节以上计3分，无肿胀计0分；新骨情况：有计1分，无计0分。②在术后第10周检测各组跟腱组织BMP-4含量。

1.5 实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测BMP-4含量 0.25%胰蛋白酶收集大鼠跟腱组织，加入适量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min离心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水，存于-70℃。提取总RNA反转录成cDNA，进行荧光定量PCR。反应条件：95℃预变性10 min(95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40个循环，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法进行相对定量分析，检测BMP-4的表达含量，GAPDH为内参。

1.6 Western印迹检测样本BMP-4含量 收集大鼠跟腱组织，提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法测定蛋白浓度；取等量蛋白上样电泳，转膜，封闭，加入抗大鼠BMP-4，4℃孵育过夜；37℃二抗(山羊抗小鼠IgG)孵育1 h后，电化学发光(ECL)显色；GAPDH作为内参。一抗：GAPDH配置比例为1∶10 000，BMP-4为1∶200；二抗，GAPDH配置比例为1∶10 000、BMP-4为1∶5 000。蛋白表达含量采取Biomad Western分析仪自动分析。

1.7 统计学方法 应用Graph Pad6.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 HO特异性指标 塞来昔布组皮温、肿胀程度、新骨形成均显著低于对照组(P<0.05)。同时，随着处理时间延长，皮温均明显降低、肿胀程度及新骨形成情况均明显减轻(P<0.05)，但对照组三个指标却未见明显变化(P>0.05)。见表1。

2.2 各组跟腱组织BMP-4蛋白和mRNA水平比较 相比于对照组，塞来昔布组2、6、10 w跟腱组织BMP-4蛋白和mRNA水平明显下调(P<0.05)；并且随着时间的延长，BMP-4蛋白和mRNA水平也相应下调。见表2，图1。

表1 塞来昔布可明显干预大鼠异位性骨化(n=10)

与对照组比较：1)P<0.05

表2 各组跟腱组织BMP-4的表达

图1 各组BMP-4表达

3 讨 论

HO是一种非肿瘤性反应性病变，病理特征表现为局部纤维组织增生、钙化及化生，伴有异位新骨形成〔1〕。临床上肘、髋关节外伤后经过治疗，后期常出现创伤性HO，导致该关节活动受限、强直、功能丧失。目前研究认为其发生机制是在创伤和手术刺激时，局部产生出血、渗出和炎症细胞浸润，再在各类活性细胞和骨生长因子的共同参与下，通过软骨内化骨或膜内化骨的诱导，血肿逐渐机化为骨组织，影响肌肉收缩的功能，导致关节僵硬〔1〕。临床上主要采用的防治方法有NSAIDs、放射治疗、二盐酸盐类药物、手术切除、物理治疗、自由基清除剂、基因治疗等。因放疗的副作用较多，二磷酸盐长期使用可导致骨质软化，一旦停药又易形成“反跳性骨化”。手术治疗应用于较严重的HO。而对于物理治疗，部分学者认为可能会加重骨化。基因和自由基清除剂治疗还没有应用于临床，有待深入研究〔2〕。因此，NSAIDs是目前临床公认的预防HO最有效的药物。Fijn等〔3〕研究指出NSAIDs能使全髋关节置换术后HO的发生率降低50%，使临床症状明显的HO降至0%～2%。目前，临床常用的预防HO的药物是吲哚美辛，其用药时间为2～6 w，强调在术后1～2 d开始给药；如果术后5～7 d开始给药，则不能阻止HO形成。但是约30%的患者因胃肠道反应而不能完成疗程〔4〕。临床常规用药时间为2～6 w，但文献报道，从2～12 w均有应用〔2〕，吴江〔7〕发现按照塞来昔布10 mg/kg剂量给予10 w能有效降低大鼠HO。

间充质细胞和BMP是诱导HO的主要活性介质〔8〕。脱钙的骨基质可以诱导HO，BMP是真正的诱导物〔9〕，其中BMP-4在遗传型HO和创伤后HO形成中起重要作用〔10〕。向孝兵〔11〕在证实清化散对创伤性HO大鼠BMP-4的影响中，将口服塞来昔布(西乐葆)作为对照组，结果显示口服西乐葆会降低BMP-4的含量，但造模后18 d才服药，与以往报道〔12〕不同。本研究提示塞来昔布可通过下调BMP-4分子以干预大鼠HO的机制。

1 陈 锐.创伤性异位骨化临床治疗研究进展〔J〕.中医临床研究，2011；3(13)：113-4.

2 闵红巍.异位骨化预防与治疗的新进展〔J〕.中国康复理论与实践，2010；19(10)：250-3.

3 Fijn R，Koorevaar RT，Brouwers JR.Prevention of heterotopic ossification after total hip replacement with NSAIDs〔J〕.Pharm Word Sci，2003；25(4)：138-45.

4 朱仕文.吲哚美辛预防髋臼骨折术后异位骨化的临床研究〔J〕.中华创伤骨科杂志，2006；8(7)：613-6.

5 徐步国.选择性COX-2抑制剂和非选择性COX-1和COX-2抑制剂在预防全髋关节置换术后异位骨化的Meta分析〔J〕.中国骨伤，2014；27(7)：609-14.

6 林 霖.骨形态发生蛋白4、脱钙骨基质和切断跟腱诱导的异位骨化动物模型的研究〔J〕.中国运动医学杂志，2008；27(4)：408-11.

7 吴 江.选择性与非选择性环氧化酶2抑制剂预防大鼠跟腱异位骨化的实验研究〔J〕.中国修复重建外科杂志，2014；28(3)：371-2.

8 Okayama A，Futani H，Kyo F，etal.Usefulness of ultrasonography for early recurrent myositis ossificans〔J〕.J Orthop Sci，2003；8(2)：239-42.

9 Aoki H，Fujii M，Imamura T,etal.Synergistic effects of different bone mohogenetic protein type Ⅰ receptors on alkaline phosphatase induction〔J〕.J Cell Sci，2001；114(Pt 81)：1483-8.

10 Shafritz A，Kaplan F.Differential expression of bone and cartilage related genes in fibrodysplasia ossificans progressiva，myositis ossificans traumatica and osteogenic arcoma〔J〕.Clin Orthop，1998；346：46-52.

11 向孝兵.清化散对创伤 性异位骨化模型大鼠BMP-4 的影响〔J〕.辽宁中医药大学学报，2010；12(10)：25-8.

12 叶勇光.两种异位骨化造模方法的比较研究〔J〕.中国中医骨伤科杂志，2010；18(2)：9-11.

〔2015-04-11修回〕

(编辑 苑云杰)

福建省自然科学基金资助项目(No.2016J01610)

曾荣东(1970-)，男，副主任医师，主要从事骨科疾病研究。

R683.13

A

1005-9202(2017)03-0540-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.008

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