猪圆环病毒二型Capsid表面五倍轴loops的研究进展

刘思远

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128;2.湖南农业大学逆向疫苗研究中心&功能蛋白组学实验室，湖南长沙410128）

猪圆环病毒二型Capsid表面五倍轴loops的研究进展

刘思远1,2

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128;2.湖南农业大学逆向疫苗研究中心&功能蛋白组学实验室，湖南长沙410128）

猪圆环病毒1型（PCV1）与猪圆环病毒2型（PCV2）的核苷酸序列高度同源，但两者的Cap蛋白结构存在较大差异且PCV1不致病。通过近年来研究两者Cap蛋白结构的文献以及比对PCV1与PCV2病毒颗粒表面五倍轴的三段loops氨基酸序列及蛋白3D结构模拟展示结果，观察Loop BC，Loop DE以及Loop HI的潜在功能和作用，本综述目的在于进一步揭示PCV2 virus-like particles(VLPs)组装及其细胞入侵分子机理，有助于PCV2疫苗及药物载体等的研究与开发，为PCV2疫苗、药物载体等研究与开发奠定理论基础。

猪圆环病毒2型；Cap蛋白；loops的结构；五倍轴

猪圆环病毒属于猪圆环病毒科（Circoviridae），圆环病毒属，是最小的病毒之一，PCV的基因大小为1759～1768 bp,分为PCV1与PCV2两种血清型，其中PCV1不致病，但PCV2每年都给世界养猪产业带来巨大的经济损失。PCV1最早在上个世纪70年代被发现做为非致病性的细胞污染物在猪肾上皮细胞（PK15）中存在。均包含了ORF1和ORF2这2个主要的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF），其中ORF1编码与病毒复制相关的Rep和Rep’蛋白，与宿主聚合酶的共同参与病毒基因的滚环复制，ORF2则反向编码病毒的唯一功能衣壳蛋白即Cap蛋白。

60个单亚基Cap蛋白可以组装成一个直径大小为17～20nm正二十面体的衣壳蛋白组装体（capsid）。根据2011年PCV2的capsid晶体结构分析指出，Cap蛋白质由8个β折叠片和（β-strands）折叠一个典型的jellyroll结构，与此同时，Cap蛋白还含有7个loops结构，这7个loop结构将上述8个β-strands连接在一起，在capsid的组装与稳定中起到很大作用，其次，在Cap蛋白的NH2端有一段富含正电荷氨基酸残基的核定位信号区（Nuclear Localization Signal,NLS）被包裹在核衣壳内部，参与病毒的基因组包装。

通过进一步分析发现，病毒的核衣壳表面大部分被loops占领，且在病毒的生长进化中loop也是突变率最高的区域，同时经比对可见PCV1与PCV2的loop区也存在巨大的差异。由于PCV2是无囊膜病毒，在于宿主细胞相互作用及随后细胞的内吞（internalization）过程中，参与中和抗体识别反应的抗原表位也多包含了病毒核衣壳表面的关键氨基酸。

近年来，我们对这些loop的功能作用知之甚少，有待深入研究，本文对近年来与Capsid表面最高峰Loop BC区域相关的文章进行了研究整理，以此为PCV2的功能结构研究与新型疫苗的开发提供参考。

1. Cap蛋白的研究进展

1.1 PCV2的基因组结构

PCV2分为三个主要基因亚型（subtypes）: PCV2a,PCV2b和PCV2c。PCV2a和PCV2b是目前世界主要流行的毒株，而PCV2c主要在丹麦报道过。根据病毒基因组的差异，PCV2a又可以分为2A、2B、2C、2D、2E五簇 (clusters)，PCV2b可以分为1A、1B、1C三簇。PCV2病毒颗粒平均大小在12～23 nm，是目前世界发现的最小动物病毒之一。被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PWMS)及圆环病毒相关疾病（Porcine Circovirus-associated Disease,PCVAD）主要病原体。

PCV2病毒基因组以ORF1与ORF2为主，其中ORF1编码与病毒复制相关的非结构蛋白即Rep与Rep’蛋白。Cap基因是PCV2的ORF2区域的基因，该基因位于PCV2病毒DNA的反向互补连上，大概含有699～702个核苷酸序列，编码病毒的唯一的功能结构蛋白即Cap蛋白，其蛋白重量为27.8 Ku，作为病毒的主要结构蛋白也是中和抗体识别的主要抗原，可利用Cap蛋白研究病毒的致病性和免疫原性，也是研制疫苗与病毒血清学诊断的的靶向蛋白。

Khayat指出，Cap蛋白经过大肠杆菌原核表达系统表达后再纯化，60个Cap蛋白质可在体外自行组装为一颗病毒样颗粒（Virus-like Particle, VLP），并且可在电镜下观察到17～20nm之间的VLPs完整形态，其形态大小均与野生型病毒颗粒一致。Cap蛋白的这种特性有助于开发PCV2的亚单位疫苗与病毒快速检测ELISA试剂盒。

1.2 Cap蛋白的氨基酸组成与结构研究

Cap基因的结构精简，由233-234个氨基酸经过正确折叠构成一个Cap蛋白，一个Cap蛋白亚基包含了Loop BC,Loop CD,Loop DE，Loop EF，Loop FG，Loop GH,Loop HI等7个长短不一的loops结构，还包括富含正电荷氨基酸的氮端在内的8个β-strands。当60个Cap蛋白组装成capsid后可见，大部分的loops区域都位于核衣壳蛋白的表面，而大部分β-strands区域则被包裹在核衣壳内部。

通过PCV1与PCV2两种血清型的氨基酸序列比对可见，PCV1与PCV2在ORF1中同源性很高。与ORF1相反，两者的氨基酸序列在ORF2中差异性很大，尤其是在各个loop区域，再结合PCV1与PCV2的Cap蛋白的3D结构图分析，同样表明了PCV1与PCV2存在明显的结构差异，由于两者在loop结构上存在差异进而影响了Cap蛋白的组装，所以也会在整个病毒的核衣壳蛋白表面产生明显的差异。可见这些loop结构不仅对维持蛋白结构稳定有着很大的作用还可能对病毒的组装和免疫存在影响，然而我们对这些loops的具体作用机制和潜在功能还尚未研究透彻。

2 Capsid上五倍轴loops的主要作用

2.1 PCV1与PCV2在五倍轴的差异

PCV1与PCV2在病毒核衣壳表面五倍轴处存在很多不同，三段富有差异性的loops结构在氨基酸序列和蛋白结构以及潜在功能上都有不同。首先，在氨基酸序列比对结果中发现PCV的Loop BC区域都不存在负电荷氨基酸，且PCV1与PCV2的Loop BC区域存在很大的差异。据王乃东等报道，PCV1的Loop BC由8个氨基酸组成而PCV2由9个氨基酸组成，两者间除了第58位的赖氨酸，以及第65位脯氨酸以及第66位的丝氨酸相同之外，59-64位的氨基酸残基均不相同。通过蛋白质3D模拟软件预测两者的构像差异分析可见PCV1的Loop BC要较小和且平缓，Loop BC区域的组合图也有明显的非重叠区域。说明，PCV1与PCV2在Loop BC的氨基酸组成与蛋白构象上都存在极大的差异，位于表面第一高峰的Loop BC也许参与中和抗体所识别的抗原表位构成。

Loop HI位于Loop BC与Loop DE之间，由简短的5个氨基酸残基组成，但在PCV1与PCV2中存在很大的差异性，两者在Loop DE中除了第204位的天冬氨酸一致外没有相同的氨基酸，且天冬氨酸在PCV1与PCV2中都高度保守。值得注意的还有，PCV2中含有206-208位的IYD基团而PCV1没有。由此可见，PCV2的Loop HI可能参与病毒的磷酸化以及有病毒入侵细胞过程中的作用。

5个Loop DE紧密相连组成了五倍轴的中心区域，PCV2的 Loop DE由 10个氨基酸残基（108CSPITQGDRG117）组成且高度保守。与PCV2相比较，PCV1的Loop DE氨基酸组成存在可变氨基酸（108RDPITS(K/N)(E/Q)RG117），然而两者在loop结构表面上差异微小[3]，且PCV2中第108位的半胱氨酸是经典的维持蛋白三维结构稳定的氨基酸，而PCV1中第108位却是赖氨酸。在PCV1与PCV2中如此不同的Loop DE到底起到了什么作用尚未可知，2012年Wu等报道，PCV2 Cap蛋白质中唯一半胱氨酸能参与亚基间二硫键的形成，结构分析发现，位于Loop DE的半胱氨酸在PCV2 VLPs体外组装和结构维持中起到关键作用，从而推测PCV2中的Loop DE可能与病毒的组装与解组装有关。

2.2 Loop BC上潜在的抗原表位

据刘昌明、孟香金等报道，通过构建突变体PCV2的感染性克隆来筛选构成病毒空间构像表位的关键氨基酸的实验证实，Loop BC区域有2个正电荷氨基酸可被PCV2的单克隆抗体所识别，分别是第59位的赖氨酸，第60位的精氨酸。然而当这三个氨基酸突变为无功能性氨基酸（丙氨酸）后，PCV2的拯救病毒便不可再被PCV2单克隆抗体识别，该实验证明，Loop BC区域是病毒构像表位的重要组成部分，且在突变后会影响病毒的感染力与免疫原性。

2.3 PCV2的capsid表面五倍轴loops的相互作用

Loop BC位于第58位至第66位氨基酸之间，Loop DE位于第108位至第117位氨基酸之间，Loop HI位于第204位至第208位氨基酸之间。通过分析Cap蛋白的空间构象，虽然在线性距离上Loop BC，Loop HI与Loop DE三者相距较远，但在Cap蛋白的空间构象上三者却距离相近甚至Loop DE第208位带负电的天冬氨酸与Loop BC第58位的赖氨酸相互靠近。5个Loop BC，5个Loop DE与5个Loop HI组成了一个capsid的五倍轴，其中Loop BC位于衣壳蛋白表面最高峰链接Loop HI形成一个“王冠”形状围绕住Loop DE。所以在蛋白结构上，这三个loops距离相近且有交叉相互作用。再者，杨毅等在2016年报道指出，在Loop BC与Loop HI之间存在多处磷酸化位点，一旦病毒进入体内后被磷酸化极有可能发生病毒结构的构象变化，从而可能会进一步参与病毒DNA的释放。

3 展望

PCV1与PCV2两者的同源性接近76%，大部分的差异存在于两者的ORF2区域，两者相对应的Cap蛋白构像存在明显差异。PCV1不致病，但PCV2是一种强大的致病源且会造成世界养猪业的巨大经济损失，所以，从病毒的基本蛋白结构入手，分析对比PCV1与PCV2的Capsid中富有差异性的loop结构，针对性的选取关键loops区域作为研究对象意义重大。综上所述，对PCV2病毒Cap蛋白质及其capsid结构与功能的研究对于揭示PCV2的分子致病机理以及对PCV2疫苗的研究、设计和开发等都具有非常重要的科学和临床意义。特别是通过比较PCV1和PCV2 Cap在基因组及蛋白质组的差异，有望揭示PCV2相关疾病的分子致病机理。□

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S852.65

A

1006-4907（2017）01-0046-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.01.021

2017-02-01

刘思远（1992～），女，汉族，研究生在读，515970802@qq.com。