溴吡斯的明新型纳米乳体外释放和大鼠在体胃肠吸收

袁誉铭，陈学梁，陈 静，李 娜，张景勍

(重庆医科大学重庆高校药物工程研究中心，重庆 400016)

溴吡斯的明新型纳米乳体外释放和大鼠在体胃肠吸收

袁誉铭，陈学梁，陈 静，李 娜，张景勍

(重庆医科大学重庆高校药物工程研究中心，重庆 400016)

目的 制备油包水型溴吡斯的明新型纳米乳(novel pyridostigmine bromide nanoemulsion, PPNE)，研究其体外释放规律及各胃肠段吸收动力学特征。方法 选用3种不同浓度pH 6.8、pH 7.4、pH 7.8的PBS以及pH 1.2的HCl作为释药介质，测定并绘制其体外释药曲线；并采用在体单向肠灌流实验模型，比较溴吡斯的明(pyridostigmine bromide，PB)和PPNE在胃肠道的吸收行为。结果 在4种释放介质中，PB释放速率较快，而PPNE释放速率相对减缓；PPNE的吸收速率常数(Ka)和表观渗透系数(Papp)较PB在十二指肠、空肠、回肠、结肠段中均增加。经t检验，PB和PPNE在4个肠段均有统计学意义(P<0.05)。结论 PPNE可提高药物的生物利用度，明显提高其药物在体肠段的吸收；体外释放中有良好的缓释效果。

溴吡斯的明；纳米乳；体外释放；透析法；单向肠灌流模型；胃肠吸收

溴吡斯的明(pyridostigmine bromide，PB)是季铵类化合物，具有可逆性抑制突触间隙内乙酰胆碱酶的作用。主要用于治疗重症肌无力，也可联合其他药物用于宫颈癌术后尿潴留、室上性心动过速综合症以及糖尿病神经源性膀胱的治疗[1-4]。在其他方面，PB也可用于治疗梭曼毒气中毒所导致的呼吸困难。目前上市的片剂，口服后吸收差，生物利用度低，半衰期T1/2短，给药频繁[5]。磷脂是两性分子，一端为含氮或磷的亲水基团，另一端则为具有疏水性的长烃基链。因此，可与药物形成复合物，增大药物的脂溶性，促进其吸收[6]。本实验将PB先与磷脂复合，再进一步制备成油包水型纳米乳，最终形成溴吡斯的明新型纳米乳(novel pyridostigmine bromide nanoemulsion, PPNE)，以期提高生物利用度[7]等。

1 材料

1.1 动物 ♂ SD大鼠，体质量230 g～250 g，重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK-(渝)2013-0001。实验前未给予其他药物。

1.2 药品、试剂与仪器 溴吡斯的明(武汉远城科技发展有限公司，纯度99.6%，批号20080302)；聚氧乙烯蓖麻油EL-35(德国BASF公司)；蛋黄卵磷脂(国药集团化学试剂有限公司)；油酸乙酯(成都科龙试剂化工试剂厂)；PEG-400(成都科龙试剂化工试剂厂)；无水乙醇(成都科龙试剂化工试剂厂)；甲醇、乙腈为色谱级；其他试剂均为分析纯。Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)。

2 方法

2.1 PPNE的制备 取PB与磷脂适量，加入一定量无水乙醇使其溶解，恒温水浴中磁力搅拌2 h，旋转蒸发除去无水乙醇，即得到溴吡斯的明磷脂复合物。油酸乙酯为油相，复合乳化剂(吐温80 ∶司盘80=2 ∶1)，PEG400为助乳化剂，20% PEG400为水相。按处方精密称取上述辅料以及干燥至恒重的磷脂复合物，再将辅料与磷脂复合物混合于40 ℃恒温水浴搅拌，使磷脂复合物(PLC)完全溶解，滴加处方量的水相，搅拌均匀即得油包水型PPNE。

2.2 体外释放动力学 选用正向动态透析法[8]比较PB与PPNE在不同释放介质中的释放特征。精密量取等浓度、等体积的PB和PPNE，把含药透析袋分别投入不同的释放介质中，溶出介质体积为500 mL，满足漏槽条件。平行操作3份，水浴恒温振荡(37 ℃，100 r·min-1)，分别于12个不同的时间点取样1 mL，同时补加等量同温的释放介质。测定透析外液PB和PPNE的含量，计算累积释放百分率，并绘制释药曲线。

2.3 在体胃肠吸收实验 实验前[9-10]，将大鼠禁食18 h(可饮水)，腹腔注射3.5%的水合氯醛麻醉，固定。沿腹中线打开腹腔，暴露胃，在贲门和幽门口处各切一个小口，结扎贲门。用人工胃液清除胃内容物，之后注入药液，结扎幽门。2 h后排出药液，冲洗剩余药液并定容。沿肠道部位分别找到十二指肠、空肠、回肠和结肠段，在4个肠段的上端和下端各剪开一个小口，插管结扎，用37 ℃生理盐水将肠内容物冲洗干净，排出生理盐水后，用37 ℃恒温的空白K-R循环液先以0.5 mL·min-1流速，循环10 min。排尽K-R液，换用含药循环液，并调节流速至0.2 mL·min-1，灌流1 h，收集灌流液，并用K-R液冲洗肠段，合并灌流液并定容，于-4 ℃保存。实验后处死大鼠，剪下肠段，测得各肠段的长度(l)和内径(r)，计算药物的吸收速率常数(Ka)和有效渗透率(Papp)。分别按以下公式[11]：Ka=(X0-Xt)/C0t；Papp=Q·ln(Xin/Xout)/2πrl，得到药物吸收的速率常数(Ka)和表观渗透系数(Papp)。公式中，X0和Xt分别为药物的初始量和灌流液中剩余药物量，Xin和Xout分别代表流入和流出的药物量，Q为灌流速度(mL·min-1)，t为灌流时间(min)，l和r分别为待测灌流肠段的长度(cm)和内径(cm)，V为待测肠段的肠管体积。

2.4 样品的分析

2.4.1 样品的处理 精密量取100 μL样品，加入甲醇，涡旋混匀，离心10 min，取上层液进行测定。

2.4.2 色谱条件的建立 色谱柱：大连伊利特Lichrospher C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈 ∶水相(0.01mol·L-1磷酸二氢钠，0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠，0.5%三乙胺，磷酸调pH至3.0)=21 ∶79，柱温：30 ℃，检测波长：269 nm，流速：1 mL·min-1，进样体积100 μL。

2.4.3 标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的PB 10.0 mg，溶于适量的纯水中，定容至10 mL，作为母液。再分别精密移取60、200、340、480、620、760、900 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到浓度分别为6、20、34、48、62、76、90 mg·L-1的PB甲醇溶液。按“2.4.2”项进样，记录峰面积，绘制标准曲线。

2.4.4 精密度实验 分别配制高、中、低(90、48、6 mg·L-1)浓度的PPNE样品溶液，按“2.4.2”项进样，平行操作，于同日内连续测定5次，重复测定5 d，分别计算日内、日间精密度。

3 结果

3.1 体外释放曲线 在体外释放中，纵坐标为累积释放率，横坐标为取样时间，绘制体外释放曲线。由Fig 1曲线得知，PPNE与PB在相同的释放介质中相比较，明显改善药物的释放行为，达到缓释作用。在不同的释放介质(pH 1.2的HCl,pH 6.8、pH 7.4、pH 7.8的PBS)中，PB前30 min的累积释放率达到(82.92±4.61)%、(84.43±4.82)%、(83.68±4.34)%、(86.43±2.85)%，而PPNE的累积释放率分别为(27.30±3.01)%、(30.91±1.30)%、(31.62±2.92)%、(33.46±3.26)%。

3.2 PB和PPNE在胃肠段的吸收 药物峰面积(A)与质量浓度(mg·L-1)做线性回归，测得标准曲线方程为A=66.02 C+70.01(r=0.999 5)，药物浓度在6～90 mg·L-1线性范围良好。日内精密度RSD分别为0.97%、1.13%、1.27%，日间精密度RSD分别为1.78%、1.53%、1.93%。

如Fig 2、3所示，PPNE在十二指肠、空肠、回肠和结肠段的Ka及Papp相对于PB均有提高。PB的Ka值由十二指肠、空肠、回肠和结肠段依次递减，而PPNE在4个肠段中的Ka分别为PB的1.40、1.45、3.97、1.36倍。PPNE的Papp在4个肠段中均增加，分别为PB的1.37、1.53、3.17、1.27倍。分别计算PB和PPNE在各肠段的表观渗透系数(Papp)，见Fig 3。经t检验，4个肠段差异均有统计学意义。PB在十二指肠段的吸收最好，结肠段次之，空肠和回肠段较差。将其制备成PPNE后，回肠段反而最好，十二指肠段次之，结肠段和空肠段较差。而PB和PPNE在胃的Ka值很小，这说明PB的主要吸收部位是小肠，胃部吸收较小。

4 讨论

溴吡斯的明属于BSC Ⅲ类药物[12]，即高溶解性、低渗透性。但口服生物利用度低，胃肠道吸收差，所用剂量较大，毒副作用加强。本文采取水滴定法将其制备成新型纳米乳，可改善药物的脂溶性，增加其在胃肠道上皮细胞的渗透性，提高药物的生物利用度。

测定药物体外释放的方法，如中国药典中记载的方法(篮法、桨法、小杯法)、透析法、室扩散法等[13-14]，其中透析法是最为常用的方法。本文采取正向动态透析法，可避免药物在处理过程中的丢失和释放介质中由于药物分解等原因导致释放介质中pH值的变化。将PB制备成PPNE后，由体外释放曲线可得知，在不同的释放介质中，PB的释放曲线基本类似。而在同一种的释放介质中，PPNE的释放速率比PB慢，具有良好的缓释效果。其原因可能是PPNE处于内水相和油水界面之间，体外释放时需要穿过油相，而减缓其释放速率。

选用在体单向肠灌流实验模型考察药物的肠道吸收特征，能在保证大鼠完整的血液循环、神经系统以及代谢功能的情况下，获得较为准确的实验数据，使其更接近生理状态。众所周知，药物的肠道吸收是一个复杂的过程，而药物的渗透性是决定这一过程的主要影响因素。据实验结果所知，PPNE较PB在这4个肠段的Ka和Papp均增加，且经t检验，PPNE在4个肠段的Papp值差异有统计学意义(P<0.05)。这都表明PPNE的渗透性增大，生物利用度提高。该原因是将PB与磷脂先制备成磷脂复合物，之后再形成油包水型纳米乳，提高药物的脂溶性，并且PPNE的磷脂成分可能与肠道上皮细胞膜成分的交换[15]，促进其吸收。

Fig 1 PPNE and PB release profile in four dissolution media

Fig 2 Absorption rate constantKaof PB and PPNE in different segments of rat intestines and stomach

*P<0.05vsPB

Fig 3 Apparent permeability coefficientPappof PB and PPNE in different segments of rat intestines*P<0.05vsPB

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Invitrorelease and gastrointestinal absorption of novel pyridostigmine bromide nanoemulsion

YUAN Yu-ming, CHEN Xue-liang, CHEN Jing, LI Na, ZHANG Jing-qing

(ChongqingResearchCenterforPharmaceuticalEngineering,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To prepare the novel pyridostigmine bromide nanoemusion(PPNE) and study its releaseinvitro, and to investigate the intestinal absorption.Methods Pyridostigmine bromide(PB) and PPNE were tested by HPLC in pH 1.2 HCl, pH 6.8, pH 7.4, pH 7.8 PBS. Rat single pass intestinal perfusion method was employed to investigate the absorption mechanism of PB and PPNE.Results PB release rate was faster than PB in the four release media; the intestinal absorption rate constant(Ka) and apparent permeability coefficient(Papp) of PPNE were increased in the duodenum, jejunum, ileum and colon segments. PB and PPNE had significant difference in the duodenum, jejunum, ileum and colon segments byttest(P<0.05).Conclusions PPNE can improve the bioavailability of drugs, increase the drugs permeability, significantly improve the absorption of the drugs in the intestinal segments. PPNE has obviously sustained effects.

pyridostigmine bromide; novel pyridostigmine bromide nanoemulsion; drug releaseinvitro; dialysis method; single-pass intestinal perfusion model; gastrointestinal absorption

时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.048.html

2016-10-31,

2016-11-28

重庆市科委资助项目(No cstc2015jcyjBX2007)

袁誉铭(1992-)，女，硕士生，研究方向：药物新剂型与新技术,E-mail：469859028@qq.com; 张景勍(1973-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：药物新剂型与新技术,通讯作者,E-mail：zjqrae01@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.024

A

1001-1978(2017)02-0276-04

R-332；R322.44；R322.45；R943.4；R971.91；R977.3