复方总黄酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

祝晓庆，杨 洁，邵 娟，刘 超，吴基良

(湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室,湖北 咸宁 437100)

复方总黄酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响

祝晓庆，杨 洁，邵 娟，刘 超，吴基良

(湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室,湖北 咸宁 437100)

目的 探讨复方总黄酮对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的保护作用。方法 15只7周龄的♂C57BL/6小鼠普通饮食为正常对照组；75只7周龄的♂ ApoE基因敲除小鼠高脂饮食，随机分为5组：模型组、辛伐他汀组、低剂量复方总黄酮组、中剂量复方总黄酮组、大剂量复方总黄酮组。灌胃16周造模完成后，采集血清，分离胸主动脉。HE染色检查胸主动脉斑块，检测血脂4项(TC、TG、LDL-C、HDL-C)和血清SOD；ELISA检测IL-1β、NF-κB值。结果 模型组胸主动脉斑块明显，复方总黄酮组斑块均不同程度变小。复方

ApoE基因敲除小鼠；动脉粥样硬化；复方总黄酮；脂质代谢；斑块；炎症

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病，胆固醇在动脉壁的积累促进动脉粥样硬化斑块的形成，血管壁的增厚与狭窄，随后导致心脑血管疾病[1]，AS作为心血管疾病的重要病理基础，是世界范围内导致死亡的主要原因[2]，成为人类健康的头号杀手，给社会带来沉重的经济和医疗负担。随着生活水平的提高和人口老年化的日益严重，AS的发病率越来越高，其防治也越来越引起了人们的重视。

生物总黄酮是一大类黄酮类天然产物，广泛存在于植物界，是许多植物的有效成分，常见于人们的日常饮食中[3]。近年研究发现，高黄酮的摄入对AS有较好的预防和治疗作用[4-5]。本文中的复方总黄酮由本实验室自行提制，主要成分是陈皮、山楂和葛花等，前期实验已证明其有非常好的抗氧化作用[6]。本文拟通过ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠高脂饮食建立AS模型，探讨复方总黄酮对其的保护作用及其可能的作用机制，为AS寻求有效的治疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 7周龄♂ C57BL/6J小鼠，体质量(20±2)g，由武汉大学动物实验中心提供，动物许可证号: SCXK(鄂)2014-0004；7周龄♂ ApoE-/-小鼠，体质量(20±2)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号:SCXK(京)2014-0004，合格证号：11401300032681，适应性喂养(SPF级)1周后开始实验。

1.1.2 高脂饲料、药品、试剂 高脂饲料购于北京华阜康生物科技有限公司；复方总黄酮(主要成分陈皮、山楂和葛花等，由本实验室自行提炼，浸膏中总黄酮的含量为870 mg·g-1)；辛伐他汀(东京化成工业株式会社)；甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，均购于南京建成生物研究所；小鼠白介素-1 beta(IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒、小鼠核因子κB(NF-κB)酶联免疫吸附测定试剂盒均购于伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，血糖仪(罗氏)，多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)，电子分析天平(德国Sartorius公司) ，光学显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药方法 实验小鼠共分为6组。75只7周龄的♂ ApoE-/-小鼠随机分成5组，每组15只：分别为模型组(M组)、辛伐他汀组(S组)、复方总黄酮低、中、高组(FL、FM、FH组)，均高脂饮食。S组每日5 mg·kg-1辛伐他汀灌胃；FL、FM、FH组每日分别给予200、400、800 mg·kg-1复方总黄酮灌胃，M组每日灌胃等体积生理盐水。15只7周龄的C57BL/6小鼠为正常对照组(C组)，普通饮食，每日灌胃等量生理盐水。连续饲养给药16周，所有动物均饲养在SPF级动物房。

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 体质量监测和血糖检测 每周一8点定时称量记录小鼠体质量。在实验第16周剪断小鼠尾巴尖端，从尾根挤压到尾稍取血，血糖测定仪检测血糖。

1.2.2.2 生化测定 小鼠眼球取血处死，全血直接取在1.5 mL EP管中，静置2 h，3 000 r·min-1，4℃离心15 min后取上清液，采用ELISA试剂盒测定IL-1β、NF-κB值。生化试剂盒测定TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD值。

1.2.2.3 病理形态学检查 取出胸主动脉，固定于4%的多聚甲醛中24 h，常规石蜡包埋切片，HE染色。光镜下观察胸主动脉形态学改变。

2 结果

2.1 复方总黄酮对小鼠体质量和血糖的影响 小鼠体质量均稳步增长，M组小鼠体质量增加幅度最大，给药组小鼠体质量增长幅度均小于模型组，但大于C组(Fig 1A)。M组血糖较C组升高，且差异有显著性(P<0.01)，给药组较M组均有降低，FM组降低差异有显著性(P<0.05)(Fig 1B)。

Fig 1 Effect of different treatment on body weight(A) and blood glucose(B) in mice

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsmodel

2.2 复方总黄酮对胸主动脉形态的影响 C组胸主动脉平滑肌细胞形态正常，排列紧密有序。内膜、中膜、外膜均未见泡沫细胞及脂质沉积；M组血管内膜有大片斑块形成，泡沫细胞堆积、部分破裂，动脉粥样硬化病灶明显；各给药组较M组胸主动脉内膜斑块明显变小，FH组小鼠胸主动脉较FL、FM组小鼠胸主动脉病变轻，血管内壁有少量泡沫细胞聚集，斑块较小(Fig 2)。

Fig 2 Histopathology of thoracic aorta in different groups(HE staining×200)

A:Control；B:Model；C:Simvastatin；D:Low compound flavonoids；E:Middle compound flavonoids；F:High compound flavonoids

2.3 生化指标

2.3.1 复方总黄酮对血脂的影响 M组的TC 、TG、LDL-C较C组均明显升高，HDL-C较C组明显降低，且差异有显著性(P<0.01)；给药组的TC、TG、LDL-C较M组均明显降低，HDL-C与M组比较明显升高，且复方总黄酮中剂量、大剂量组与M组相比差异均有显著性(P<0.05)(Fig 3)。

2.3.2 复方总黄酮对SOD的影响 M组的SOD值较C组明显降低，且差异有显著性(P<0.01)。给药组的SOD值均有升高，FM、FH组与M组相比差异有显著性(P<0.05)(Fig 4)。

2.3.3 复方总黄酮对IL-1β、NF-κB的影响 M组的IL-1β、NF-κB值较C组均明显升高，且差异有显著性(P<0.01)，给药组均有所降低，FM、FH组降低与M组相比差异有显著性(P<0.05)(Fig 5)。

3 讨论

AS是胆固醇和脂质积累在血管内壁的一种慢性血管性炎性病变，其特征是血管内壁有脂质斑块，管腔内变窄和变硬。AS发病机制非常复杂，大量研究显示，异常的脂质代谢和慢性炎症在AS的发生发展中起着重要的作用[7-8]。

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 4 Effect of different treatment

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 5 Effect of different treatment on serum

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

他汀类药物是心血管疾病一级预防和二级预防的基石，但其并不能解决所有的血脂异常相关问题，且长期使用会导致多种副作用，如肝损伤、肌肉毒性等[9-10]。因此，我们在充分重视他汀类药物核心地位的同时，也在试图寻求新的药物，植物来源的黄酮类化合物备受关注。已知黄酮类化合物是一类大自然中广泛存在的多分子天然化合物，为植物体多酚类的代谢物，已报道了10 000多个结构物[11]。本研究以ApoE-/-♂ 小鼠高脂饮食复制AS模型，给予复方总黄酮治疗，目的在于探究复方总黄酮对AS小鼠的早期干预作用。16周后，黄酮组斑块明显减小，血清中血脂和炎症因子水平明显下降，抗氧化水平明显增强。

一些研究表明，黄酮类化合物包括淫羊藿苷[12]、山柰酚[13]等能有效降低AS动物模型体内的血脂水平，在本实验中复方总黄酮也能较好改善血脂代谢异常,与已知文献一致。IL-1β是致AS的重要炎性细胞因子。实验研究显示，缺乏IL-1β或IL-1受体的小鼠颈动脉内膜增生减轻；相反，IL-1受体拮抗剂缺乏的小鼠易发生AS[14]。人IL-1β的单克隆抗体Canakinumab，能选择性中和IL-1β，降低IL-6等炎症因子的产生，抑制炎症反应，产生抗AS作用[15]。NF-κB是“Rel”家族中一个重要转录因子,NF-κB参与炎症反应中的多种信号通路，对AS的发生发展过程起着重要作用[16]。在Leyva-Lopez等[17]研究中表明，黄酮类化合物能调节免疫功能，减少炎性细胞因子，如IL-1β、NF-κB,可治疗炎症相关疾病。超氧化物歧化酶(SOD)是目前研究最多的一种自由基清除剂，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活性与血管功能有着密切关系[18]。在我们的研究中，复方总黄酮组的SOD明显升高，IL-1β、NF-κB明显下降，说明复方总黄酮较好地提高了机体的抗氧化能力，其抗炎效应也与已知文献报道相一致。

综上所述，复方总黄酮可能通过调节血脂紊乱，抑制炎症反应来减缓小鼠动脉粥样硬化进程，我们的研究可能为AS 的药物治疗提供新思路。

[1] Qin L, Zhu N, Ao B X, et al. Caveolae and caveolin-1 integrate reverse cholesterol transport and inflammation in atherosclerosis[J].IntJMolSci, 2016,17(3): 429-45.

[2] Witztum J L, Lichtman A H. The influence of innate and adaptive immune responses on atherosclerosis[J].AnnuRevPatholMech, 2014,9(1):73-102.

[3] Zhang X, Wang G, Gurley E C, et al. Flavonoid apigenin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response through multiple mechanisms in macrophages[J].PLoSOne, 2014,9(9): e107072.

[4] Choi J S, Choi Y J, Park S H, et al. Flavones mitigate tumor necrosis factor-alpha-induced adhesion molecule upregulation in cultured human endothelial cells: role of nuclear factor-kappa B[J].JNutr, 2004,134(5): 1013-9.

[5] Choi J S, Choi Y J, Shin S Y, et al. Dietary flavonoids differentially reduce oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells: role of MAPK-and JAK/STAT-signaling[J].JNutr, 2008,138(6): 983-90.

[6] 查文良, 柯志强, 高 卉, 等. 复方总黄酮对小鼠慢性酒精性睾丸损伤的作用研究[J]. 中国药理学通报, 2016,32(2): 285-8.

[6] Zha W L, Ke Z Q, Gao H, et al. Protective effects of compound flavones against chronic alcohol-induced testicular injury in mice[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(2): 285-8.

[7] Lusis A J. Atherosclerosis[J].Nature, 2000,407(6801): 233-41.

[8] Rader D J, Daugherty A. Translating molecular discoveries into new therapies for atherosclerosis[J].Nature, 2008,451(7181): 904-13.

[9] Rader D J, Daugherty A. Translating molecular discoveries into new therapies for atherosclerosis[J].Nature, 2008,451(7181): 904-13.

[9] Maron D J, Lu G P, Cai N S, et al. Cholesterol-lowering effect of a theaflavin-enriched green tea extract: a randomized controlled trial[J].ArchInternMed, 2003,163(12): 1448-53.

[10]Bradford R H, Shear C L, Chremos A N, et al. Expanded clinical evaluation of lovastatin(EXCEL) study results. I. Efficacy in modifying plasma lipoproteins and adverse event profile in 8245 patients with moderate hypercholesterolemia[J].ArchInternMed,1991,151(1): 43-9.

[11]Agati G, Azzarello E, Pollastri S, et al. Flavonoids as antioxidants in plants: location and functional significance[J].PlantSci,2012,196(3): 67-76.

[12]Zhang Z K, Li J, Yan D X, et al. Icaritin inhibits collagen degradation-related factors and facilitates collagen accumulation in atherosclerotic lesions: a potential action for plaque stabilization[J].IntJMolSci, 2016,17(2):169-84.

[13]Kong L, Luo C, Li X, et al. The anti-inflammatory effect of kaempferol on early atherosclerosis inhigh cholesterol fed rabbits[J].LipidsHealthDis, 2013,12(1):115-26.

[14]Kirii H, Niwa T, Yamada Y, et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2003,23(4): 656-60.

[15]Ridker P M, Howard C P, Walter V, et al. Effects of interleukin-1beta inhibition with canakinumab on hemoglobin A1c, lipids, C-reactive protein, interleukin-6, and fibrinogen: a phase IIb randomized, placebo-controlled trial[J].Circulation, 2012,126(23): 2739-48.

[16]Monaco C, Andreakos E, Kiriakidis S, et al. Canonical pathway of nuclear factor kappa B activation selectively regulates proinflammatory and prothrombotic responses in human atherosclerosis[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2004,101(15): 5634-9.

[17]Leyva-Lopez N, Gutierrez-Grijalva E P, Ambriz-Perez D L, et al. Flavonoids as cytokine modulators: a possible therapy for inflammation-related diseases[J].IntJMolSci, 2016,17(6):921-36.

[18]Romero M, Jimenez R, Sanchez M, et al. Quercetin inhibits vascular superoxide production induced by endothelin-1: role of NADPH oxidase, uncoupled eNOS and PKC[J].Atherosclerosis, 2009,202(1): 58-67.

Effect of compound flavonoids on atherosclerosis in ApoE-/-mice

ZHU Xiao-qing, YANG Jie, SHAO Juan, LIU Chao, WU Ji-liang

(HubeiKeyLaboratoryofCardiovascular,CerebrovascularandMetabolicDiseases,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

Aim To investigate the protective effect of compound total flavonoids on atherosclerosis in ApoE-/-knockout mice.Methods Seven-week old C57BL/6 mice considered of the normal group(n=15);seven-week old ApoE-/-mice were fed with high-fat diet and were assigned randomly into 5 groups: model group, simvastatin group, the low compound flavonoids group, the middle compound flavonoids group and the high compound flavonoids group. After 16 weeks, mice serum and aortas were harvested. The formation of atherosclerotic plaque was analyzed by HE staining, The serum level of lipids profiles and superoxide dismutase(SOD)were deterrnined. The levels of IL-1β and NF-κB in serum were detected by ELISA assay.Results Area of atherosclerotic lesion was significantly less in the compound flavones group than in model. The level of TC，TG，LDL-C，IL-1β，NF-κB in serum of the compound flavonoids group were decreased significantly, while SOD and HDL-C increased significantly compared with the model group, and the difference was significant(P<0.05).Conclusion The compound flavonoids have a good protective effect on early atherosclerosis in mice, which may be due to its alleviating effects on hyperlipidemia and inflammation and oxidation.

ApoE knockout mice; atherosclerosis; compound flavonoids; lipid metabolism; plaque; inflammation

时间：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.016.html

2016-10-11，

2016-11-17

国家自然科学基金资助项目(No 81270355)

祝晓庆(1983-)，女，硕士生，研究方向：心血管药理学，E-mail:179503030@qq.com; 吴基良(1963-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学、临床药学，通讯作者，E-mail:xywjl@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.008

A

1001-1978(2017)02-0180-05

R-332；R284.1；R344；R364.5；R543.501

总黄酮组的TC、TG、LDL-C、IL-1β、NF-κB明显降低，HDL-C、SOD含量明显升高，与模型组比较差异有显著性(P<0.05)。结论 复方总黄酮对小鼠早期动脉粥样硬化有良好的保护作用，可能与其降脂抗炎作用有关。