布鲁氏菌病患者血清sTim-3/HMGB1水平及外周血单个核细胞产生TGF-β斑点形成细胞的变化①

庞 盼 朱玥洁 胡金伟 贾 斌 甫拉提·热西提 张峰波 丁剑冰

(新疆医科大学第一附属医院检验科，乌鲁木齐830011)

·临床免疫学·

布鲁氏菌病患者血清sTim-3/HMGB1水平及外周血单个核细胞产生TGF-β斑点形成细胞的变化①

庞 盼 朱玥洁②胡金伟 贾 斌 甫拉提·热西提③张峰波 丁剑冰

(新疆医科大学第一附属医院检验科，乌鲁木齐830011)

目的：探讨布鲁氏菌病患者体内可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(sTim-3)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和转化生长因子-β(TGF-β)的变化特点，分析这些变化与布鲁氏菌感染的关联性。方法：28例未经治疗布鲁氏菌病患者为布病病例组，28例在年龄和性别上与布病病例组匹配的健康人为对照组，采用ELISA法检测了布病病例组和对照组血清中sTim-3和HMGB1的水平，通过ELISPOT法检测了这些患者外周血单个核细胞(PBMC)经布鲁氏菌抗原刺激产生TGF-β的斑点形成细胞(SFC)。结果：与正常对照组相比，布鲁氏菌病患者血清中sTim-3和HMGB1水平及PBMC中产生TGF-β的SFC均明显增高(P<0.01)；产生TGF-β的SFC与血清HMGB1水平呈正相关性(P<0.05)。结论：布鲁氏菌病患者血清中sTim-3和HMGB1升高，且在布鲁氏菌抗原刺激后PBMC中产生TGF-β的SFC亦升高，这些分子可能参与了布鲁氏菌感染发生发展的过程，并与免疫逃避有关。

sTim-3；HMGB1；TGF-β；布鲁氏菌病

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌(Brucella)感染引起的最常见的人畜共患传染病[1-3]。全球每年大约50多万例新发布病患者[4],以青壮年男性居多，高发于以畜牧业基地为主的农牧区[5]。人主要通过接触感染的动物或被污染的肉、奶制品等经皮肤和消化道等不同途径感染布鲁氏菌[6]。该菌侵入机体后被吞噬细胞吞噬，成为胞内寄生菌，到淋巴结繁殖形成感染灶；突破淋巴结进入血循环形成菌血症，表现为发热。该菌随后又侵入宿主肝、脾和骨髓等器官，发热消退，在寄生的脏器中大量繁殖，再次入血形成菌血症而致体温升高，如此反复，形成临床上的波浪热，伴随关节痛和全身乏力等症状。

共抑制分子Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)主要表达于CD4+辅助性T1细胞(T helper 1，Th1)和CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic lymphocyte，TCL)、调节性T细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)和树突状细胞(Dendritic cells，DCs)的表面，通过与其配体半乳凝素9(Gal-9)结合，抑制T细胞活化和增殖，从而负性调控机体的免疫应答[7]。可溶性Tim-3(soluble Tim-3，sTim-3)是膜型Tim-3的可溶性分子；作为共抑制分子，同样在T细胞介导的免疫应答和细胞凋亡中起重要作用[8,9]。文献报道已证实，膜型Tim-3和可溶性Tim-3的高表达在机体慢性病毒感染、肿瘤免疫逃逸等的发生发展中均扮演重要角色[10-12]。可作为T细胞功能耗竭的主要标志分子之一。HMGB1(High mobility group box 1，HMGB1)是sTim-3的配体，也是重要的促炎细胞因子，可诱导机体产生多种细胞因子、趋化因子和活性氧等,进而导致炎症或细胞组织损伤[13]。sTim-3/HMGB1的相互作用可抑制核酸介导的固有免疫应答，导致肿瘤发生[14，15]。然而，sTim-3/HMGB1在布病患者中的表达变化目前并不清楚，因此很有必要了解布病患者血清中的sTim-3及其配体HMGB1的变化特点，分析sTim-3/HMGB1与布病的关系，为布病治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 资料 收集2015年2月至2016年1月在新疆医科大学第一附属医院感染科就诊的28例未治疗且已明确诊断的布病患者，年龄为24～58岁，中位年龄为38岁，其中男性患者19例，女性患者9例。布病的诊断标准按照布鲁氏菌病诊断标准(WS268-2007)，临床表现为发热、骨关节痛、全身乏力等，采用虎红平板凝集试验进行初筛，阳性者进一步采用试管凝集试验检测血清中抗布鲁氏菌特异性抗体，滴度≥1∶50为阳性。选取28例同期体检的健康人群作为正常对照组，年龄和性别均与病例组匹配。所有对照及患者均签署知情同意书，本研究经新疆医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准(20150225-94)。

1.2 方法

1.2.1 血清sTim-3和HMGB1的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测布病患者组和正常对照组血清中sTim-3及HMGB1的含量，将收集到的28例布病患者组与28例正常对照组血清置-80℃的冰箱中保存备用。人sTim-3 ELISA 试剂盒和人HMGB1 ELISA 试剂盒均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司，检测的操作严格按照试剂盒中说明书进行。将sTim-3及HMGB1标准品梯度稀释后制作标准曲线各浓度，空白调零，以吸光度值为纵坐标，标准品为横坐标，绘制标准曲线。xMark酶标仪(Bio-Rad)进行吸光值读数，计算待测血清sTim-3及HMGB1的浓度值。

1.2.2 酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测转化生长因子-β(TGF-β) 采用ELISPOT法检测布病患者组和正常对照组外周血PBMC中TGF-β的斑点形成细胞数(Spot forming cells，SFC)，检测试剂盒购于美国R&D公司。采抗凝血3 h内分离PBMC，在包被特异性抗人TGF-β抗体的96孔ELISPOT板，每孔加入100 μl培养液调至终浓度为2×105个PBMC。每份PBMC样本加3个孔，即100 μl PBS为阴性对照孔；终浓度为5 μg/ml植物血凝素(PHA)为阳性对照孔；终浓度为5 μg/ml布鲁氏菌重组蛋白抗原(rOMP31)(新疆医科大学第一附属医院检验科制备)为实验刺激孔，置37℃二氧化碳培养箱培养24 h，整个操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将ELISPOT板置于ELISPOT自动读板仪(AID Elispot Reader，德国AID公司)内，调节好合适的参数，进行斑点计数。

2 结果

2.1 正常对照组和布病患者组血清sTim-3的水平 用ELISA法检测布病患者组血清sTim-3的水平为(13.20±1.83) ng/ml，正常对照组血清sTim-3的水平为(7.09±3.23) ng/ml。与正常对照组相比，布病患者组血清中sTim-3的表达明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01，图1)。

2.2 正常对照组和布病患者组血清HMGB1的水平 用ELISA法检测布病患者组血清中HMGB1水平为(23.34±5.57) ng/ml，正常对照组血清中HMGB1水平为(12.85±6.68) ng/ml。与正常对照组相比，布病患者组血清中HMGB1的表达明显增高，差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。

图1 布病患者组与正常对照组血清中sTim-3的水平Fig.1 Patients infected with brucella group and control group sTim-3 level in serumNote: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

图2 布病患者组与正常对照组血清中HMGB1的水平Fig.2 Patients infected with brucella group and control group HMGB1 level in serumNote: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

图3 ELISPOT检测布鲁氏菌重组抗原(rOMP31)刺激PBMC分泌TGF-β的SFCFig.3 Spot forming cells of secreting TGF-β from peripheral blood mononuclear cell stimulated by rOMP31Note: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

2.3 ELISPOT法检测布病患者组和正常对照组TGF-β的SFC 在重组蛋白OMP31刺激下，布病患者分泌TGF-β的SFC中位数为151(182，281)，正常对照组分泌TGF-β的SFC中位数为13(4.5，28)；布病患者组PBMC中分泌TGF-β的SFC数远远大于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.01,图3和图4)。然而，在PHA和PBS条件下，布病患者和正常对照组PBMC中分泌TGF-β的SFC中位数无统计学差异。经重组蛋白OMP31刺激的布病患者组PBMC中分泌TGF-β的SFC显著高于阴性对照下的相同个体SFC，差异具有统计学意义。

图4 ELISPOT检测PBMC中分泌TGF-β的SFC照片Fig.4 Spot forming picture of secreting TGF-β by ELISPOTNote: A，B and C represents secreting of TGF-β in the brucellosis group;D，E and F represents secreting of TGF-β in the control group ;A and D by stimulating rOMP31 protein;B and E by stimulating PHA； C and F by stimulating PBS.a represents count range,b represents the hole wall.

图5 布病患者组PBMC中分泌TGF-β SFC与血清HMGB1水平的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of spot forming cells secreting TGF-β and HMGB1

2.4 布病患者组PBMC中分泌TGF-β斑点数与血清sTim-3和HMGB1水平的相关性分析 通过Spearman法进行相关性分析发现，布病患者组PBMC中分泌TGF-β的SFC与血清中sTim-3水平不相关(P>0.05)，但与血清中HMGB1的水平呈正相关(r=0.425,P=0.024，图5)。

4 讨论

布病的早期症状多不明确，容易发生诊断不清，耽误治疗，使病情拖延至慢性期而导致患者终身难愈[16,17]。目前缺乏有效的治疗慢性布病的方法，因此，研究布病的发病机制，寻找布病的治疗靶点就显得尤为重要。

布鲁氏菌作为胞内寄生菌感染宿主后，主要以CD4+T淋巴细胞引起的细胞免疫为主，且Th1细胞分泌的细胞因子起关键保护作用[18]。当布鲁氏菌感染至慢性期，转为以Th2细胞介导的免疫应答为主，不利于宿主对体内布鲁氏菌的清除[19]。已知，免疫分子Tim-3和sTim-3均可与T细胞表面的配体结合抑制Th1细胞的增殖和功能[20]。Ren等[21]认为sTim-3在脓毒血症、细粒棘球蚴病和结核病中升高，可抑制Th1分泌IFN-γ，导致Th1/Th2细胞失衡，在病原体感染中起重要的免疫抑制作用。亦有研究表明，HMGB1与受体Tim-3结合，可阻断机体的抗肿瘤免疫应答，导致肿瘤生长和浸润[22-24]。当HMGB1异常高表达，可促进Treg细胞的分泌，减少Treg细胞凋亡以及增强Treg细胞介导的免疫抑制作用[25]。本研究结果显示，布鲁氏菌患者血清中sTim-3 和HMGB1的表达均显著高于正常对照组，可能造成Tim-3与其配体HMGB1的结合增加，从而负性调控特异性T细胞介导的免疫应答，不利于机体抵抗布鲁氏菌的侵入。TGF-β1作为一个细胞抑制因子,能在布病患者体内抑制IFN-γ激活巨噬细胞的杀菌功能和促进Treg细胞的免疫抑制功能而发挥重要的负性调控作用[26,27]。本研究发现，与正常人比较，在布鲁氏菌重组蛋白(rOMP31)的刺激下，布病患者PBMC分泌TGF-β的细胞斑点数显著增多。进一步相关性分析显示，布病患者PBMC中分泌TGF-β的细胞斑点数与血清HMGB1水平呈正相关。

总之，根据本研究的发现，我们推测布鲁氏菌感染可以刺激机体sTim-3/HMGB1信号通路的激活，抑制Th1细胞的免疫功能，并产生较多的TGF-β。TGF-β是Treg细胞等分化和发挥功能必需的细胞因子，Treg细胞数量的增多和功能增强又进一步抑制机体的免疫功能。同时，布病患者体内高表达HMGB1也可促进Treg细胞分泌TGF-β，使感染的细菌逃避宿主的免疫攻击，有助于在体内增殖扩散。然而，由于本研究观察的布鲁氏菌病患者数量有限，且尚未进行免疫功能的评价。因此，亟待加大临床样本量，并通过各种功能性研究以验证我们的推测。

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[收稿2016-06-14 修回2016-10-12]

(编辑 倪 鹏)

Changes of sTim-3/HMGB1 and Spot forming cells of TGF-β secreting from peripheral blood mononuclear cell in patients infected with brucella

PANGPan,ZHUYue-Jie,HUJin-Wei,JIABin,REXITI·Fulati,ZHANGFeng-Bo,DINGJian-Bing.

DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China

Objective:To investigate the changes of sTim-3，HMGB1 and TGF-β in the brucellosis patients and to analyse the relationship between the changes of these molecules and brucella infection.Methods: 28 cases of brucellosis patient untreated and 28 healthy control cases in the age and gender matched with brucellosis cases were collected.The serum levels of sTim-3 and HMGB1 were detected by ELISA,and the levels of Spot forming cells secreting TGF-β were measured by ELISPOT in patients and healthy control group.Results: Compared with healthy controls,sTim-3/HMGB1 expression levels and Spot forming cells secreting TGF-β were significantly increased in the brucellosis patients (P<0.01).The changes of Spot forming cells secreting TGF-β were positively correlated with the levels of HMGB1 (P<0.05).Conclusion: The serum levels of sTim-3/HMGB1 and Spot forming cells of secreting TGF-β from peripheral blood mononuclear cell are significantly increased in the brucellosis patients.Those molecules may be involved in the process of brucella infection and may play a significant role in the immune escape of patients infected with brucella.

sTim-3；HMGB1；TGF-β；Brucellosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.017

①本文为国家自然科学基金项目(81560322)、新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2015211C100)和新疆医科大学科学创新基金(XYDCX201507)。

庞 盼(1990年-)，女，在读硕士，主要从事布鲁氏菌感染方面的研究，E-mail: 2449579487@qq.com。

及指导教师：张峰波(1982年-)，男，博士，主管技师，主要从事病原学方面的研究，E-mail: 765219598@qq.com。 丁剑冰(1960年-),女，博士，教授，免疫教研室主任，博士生导师，主要从事感染免疫和生殖免疫方面的研究，E-mail: djbing002@sina.com。

R392.11 R378.5

A

1000-484X(2017)02-0247-05

②共同第一作者。

③新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐830011。