金银花对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其机制

娄序笙,胡京红,葛东宇,鲁卫星*

(1.北京中医药大学第三附属医院 心血管内科,北京100029;2.北京中医药大学中医学院科研实验中心,北京 100029)

金银花对病毒性心肌炎小鼠的保护作用及其机制

娄序笙1,胡京红2,葛东宇2,鲁卫星1*

(1.北京中医药大学第三附属医院 心血管内科,北京100029;2.北京中医药大学中医学院科研实验中心,北京 100029)

目的:研究中药金银花对柯萨奇B3(CVB3)病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用。方法:将BALB/c小鼠随机分为正常对照组，模型组，金银花低剂量组、金银花高剂量组，灌胃给药3周。各组于CVB3感染后第7、14、21天分批处死,取心脏做组织病理学检查,同时分别用黄嘌呤氧化酶法和硫巴比妥酸法测血清、丙二醛(MDA)含量与心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性,比较各组小鼠在第7、14、21天心肌组织检测的SOD活性和MDA测定值。结果:高剂量组、低剂量组在第14天、21天小鼠活性均明显高于病毒对照组,MDA含量明显低于病毒对照组(P<0.05);高剂量组、低剂量组在第21天血清SOD活性和MDA含量基本恢复正常;各组小鼠在第7、14、21天心肌组织检测的SOD活性和MDA测定值均出现不同程度的变化，各中药组小鼠心肌炎症性病理变化均明显减轻。结论:金银花能减轻CVB3感染小鼠氧自由基损伤,对VM小鼠心肌具有保护作用。

金银花;病毒性心肌炎;柯萨奇病毒感染;氧自由基；保护作用；机制

病毒性心肌炎(VMC)在现今社会成为最普遍的心肌炎之一,感染率呈上升趋势,其中多于三分之一的病例有病变的可能,病死率极高[1]。至今为止没有合适方法进行根治。临床研究发现，中医治疗有一定的成效,很多相关报道，中医具有独到优势且具有理论特色[2-6]。

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VM)的诱导因素较多，感染率也逐年上升[7]，病毒性心肌炎的关键病原体是柯萨奇病毒B3(CVB3)[8]，其发病机制主要是病毒侵入人体对心肌产生直接损伤以及免疫反应[9]。最近几年临床数据的对比研究以及医疗器械的发展探索得知氧自由基也是导致心肌炎发病的因素之一。本文通过探究金银花对VM小鼠血清及心肌组织中丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及心肌病理改变的影响,探索金银花的治疗效果，为临床提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

CVB3Nancy株为标准株,军事医学科学院病毒学研究所-80℃保存,实验前复苏。病毒在HeLa细胞上传代冻融3次,活化增殖后,采用Reed-Muench微量法滴定,其滴度为10-7TCID50/mL,实验用100 T CID50/mL。

1.1.2 药品与试剂

超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒和丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,产品批号是SOD(A001-1),MDA(A003-1)。中药金银花购自北京中医药大学第三附属医院中药房，药品批号:1102023。金银花煎液:将中药房金银花常规煎煮3次,过滤去渣,混合,再浓缩配成0.5 kg/L和1 kg/L的煎液。

1.1.3 动物与仪器

纯种BALB/c小鼠,雄性,鼠龄4～6周,体质量15～18 g，购自北京中医药大学基础实验动物中心SPF级饲养室，动物许可证号SCXK-(军)2007-004。

全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo，美国)。Trizol(Invitrogen 公司，美国)，SYBR GreenⅠ荧光染料(KAPA Biosystem公司,美国),引物(上海生工公司合成),实时定量聚合酶链反应(PCR)仪(ROCHE Light-Cycler480,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 依据研究数据确定参与实验的动物和病毒数量

按随机数表选取180只BALB/c小鼠，将其随机分为4组,正常对照组(A组,45只),病毒对照组(B组,45只),中药低剂量组(C组,45只),中药高剂量组(D组,45只),实验当日正常对照组小鼠每只腹腔无菌注射不含CVB3的MEM Eagle’s液0.1 mL，饲养于常规实验室。其他组腹腔无菌注射0.1 mL 1.0×10-5CVB3病毒,诱导小鼠VMC模型,在隔离实验室饲养。中药金银花煎液根据人与小鼠的标准公斤体重剂量折算方法[5],接种病毒0.5 h采用灌胃法给药，金银花低剂量组以0.5 kg/L金银花煎液灌胃;金银花高剂量组以1 kg/L的金银花煎液灌胃;正常对照组和模型组以等量生理盐水灌胃作为对照。各组按0.025 mL/g灌胃,1次/d,连续21天。(金银花增强小鼠免疫功能的研究)每组于接种病毒后7天、14天、21天处死。取心脏和血清标本。

1.2.2 标本采集

标本采集时间定于小鼠接受病毒接种后的第7、14、21天，这3天时在每组小鼠中随机选取15只处死,在第21天时各组将剩余的小鼠处死,摘除小鼠的眼球并取血采用离心技术制得血清,将血清分装在-20℃的环境中备用。在无菌环境中解剖小鼠取得心脏并称其质量，后取心脏左侧部分运用10%的中性甲醛进行固定。

1.2.3 病理学检查

使用常规的石蜡包埋从小鼠体内取得的心肌标本,在左心室方向进行连续性的切片,后运用光镜研究HE染色心肌病理变化,依据Rezkalla方法对心肌病理组织学积分进行计算。小鼠心肌标本包埋、染色、切片和观察在北京中医药大学中医学院科研实验中心完成。

1.2.4 SOD和MDA检测

运用黄嘌呤氧化酶法对各组小鼠进行SOD检测,运用TBA(thibabituric acid,硫巴比妥酸)法对其进行MDA检测,详细操作试剂盒中有具体说明。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况和生存率分析

对照组之外的其他组接种CVB3的小鼠第3天开始松毛，进食饮水减少或者拒食，懒动，体质量减轻，其中17只小鼠出现精神烦躁并好动的现象。C、D组死亡率低于B组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 各组小鼠病死情况

图1 各组小鼠生存率曲线

2.2 心肌组织病理学检查结果

运用光镜对小鼠的心肌组织病理进行检查，患病小鼠在第7天出现首例小血管炎;在第14天各组小鼠均出现大量心肌变性、坏死以及炎性细胞浸润的状态,此态正是传统的病毒性心肌炎改变的标志;在第21天各组小鼠体内肌纤维出现钙化以及溶解吸收的趋势,整体出现恢复性改变的特征(见表2)。中药治疗各组小鼠出现心肌病变的状况相对而言明显减轻,其中C、D两组在第21天的心肌结构一定程度上恢复正常。心肌组织病理学积分结果，见表2。

表2 CVB3病毒感染小鼠不同时期心肌病理积分

注：与B组比较,a、cP<0.002；与C组比较,b、dP<0.05

2.3 各组小鼠不同时期的SOD活性比较

第7天各组小鼠血清中的SOD活性无显著变化,此后呈下降趋势,在第14天达到低谷。各用药组小鼠的血清SOD活性相对于对照组升高。第7天时C、D两组的小鼠的SOD活性较A组小鼠高,采用中药治疗的小鼠血清SOD活性在第21天一定程度上恢复正常,见表3。

2.4 各组小鼠不同时期的MDA值比较

在第7天各组小鼠血清MDA值增大,在第14天达到顶峰,在第21天呈现降低趋势并略高于正常值。各用药组小鼠血清MDA值相对较低，见表4。

表3 实验各组小鼠血清SOD活性、MDA测定值

注：与正常组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05

表4 实验各组小鼠心肌组织SOD活性、MDA测定值

注：与正常组比较,aP<0.05；与模型组比较,bP<0.05

3 讨论

病毒性心肌炎是一种以心肌炎症为主的病症，其主要诱发因素是病毒，病毒因素多种多样，其中多为肠道病毒，肠道病毒当中的柯萨奇B组病毒(CVB)较为普遍。病毒性心肌炎具有极高的死亡率，发病过程较快，主要分为两个阶段：第1周主要是机体受到病毒侵蚀后造成心肌细胞损伤，第2周出现针对病毒的细胞免疫以及体液免疫状况，后造成心肌细胞损害，此时为更大范围的损害。氧自由基(oxygen free radical,OFR)损伤生物大分子发挥基础作用造成机体的衰老以及造成各种疾病并促使其恶性发展。生物机体中氧自由基时常发生失衡的情况，而SOD可维持其动态平衡。MDA是反映机体之中脂质过氧化的程度以及氧自由基水平的重要指标，可以作为中间产物参与到脂质过氧化的反应之中。实验数据表明，氧自由基作为重要因素参与病毒性心肌炎的发病[10],由此临床上医师对于氧自由基的作用做出肯定。通过实验数据得知，各组小鼠体内SOD出现下降的趋势,相对的LPO则呈现上升趋势[11]。病毒感染严重损害机体正常机能，导致心肌离子泵功能下降，腺苷酸酶的活性降低，从而使心肌细胞难以承载钙离子,心肌正常的能量代谢受到干扰，提高磷脂酶的活性从而产生氧自由基,心肌炎严重时导致缺血缺氧甚至产生威胁极大的炎症，造成炎症的巨噬细胞使得细胞严重耗氧，从而促进了葡萄糖的代谢，耗氧过程中发生还原作用产生大量的氧气从而合成大量的OFR,最终使细胞中的细胞膜以及线粒体发生变化，对细胞造成严重损害，最终导致机体受损[12]。OFR可消耗大量的SOD,从而导致SOD的活性呈现一定程度的降低。在此研究中,对照组的小鼠血清中SOD和MDA含量的变化都可以证明氧自由基数量增多,从而验证了氧自由基是病毒性心肌炎的诱发因素之一[13]。由此可得，清除机体中的氧自由基对治疗病毒性心肌炎具有重要意义。

中医学无病毒性心肌炎的病名，但是根据此病的临床症状可将其归属于“怔忡”“心悸”“温病”等范畴，历代名医对于此病无明确定论，因此大多将其归因于感受外邪[14]。金银花早在秦汉时期的中药学专著《神农本草经》中，就载有忍冬,称其“凌冬不凋”。金银花具有清热解毒、疏散风热功效。《本草纲目》载:“金银花,善于化毒,故治痈疽、肿毒、疮癣……”。自古以来,金银花常用于清热解毒,治疗温病发热,热毒血痢,痈疡等症,亦用于风热感冒,支气管炎等病症[15]。现代药理研究表明,金银花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解热、调节等临床作用。大量的临床实践和动物实验研究证明其有增强非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫的作用。因此,可为临床应用抗病毒感染治疗提供理论依据，对病毒性心肌炎有明显的治疗作用。本实验结果显示,经过金银花治疗的各组小鼠的心肌病理减轻，促进SOD活性的提高，与此同时MDA含量减少,有效地抑制了氧自由基对心肌细胞的损伤，利于病毒性心肌炎治疗也为进一步的探究奠定基础。

大量研究显示,SOD水平的下降以及MDA含量的上升是患有病毒性心肌炎的小鼠及患者机体之中脂质过氧化反应的重要表现。病毒侵入机体后使心肌细胞受损，从而产生大量的氧自由基，氧自由基对细胞膜有重要的作用，其作用于高价不饱和酸会产生脂质自由基，在此过程中机体发生氧化反应使得细胞膜结构发生异变，最终也会导致心肌细胞发生再次损伤。本文实验所得数据表明，金银花对于病毒性心肌炎的治疗效果取决于治疗手段对氧自由基的抑制程度[14-15]。线粒体膜受到ROS的影响，ROS在机体中一方面受到氧化反应较为直接，另一方面可通过Fas或者线粒体进行调节较为间接。数据得出，金银花可抑制氧自由基的活性从而防止氧化，避免病毒感染带来的机体损伤。此外,数据比较显示，应用药物组小鼠体内的SOD水平明显提高，MDA含量降低，说明金银花可抑制氧自由基从而抗氧化。金银花可抵抗柯萨奇B组病毒感染，可调节患者机体中心肌细胞的SOD活性从而达到抑制氧自由基损伤的目的，是临床治疗病毒性心肌炎的重要生物药剂。中医方面也有越来越多的研究以及报道，其中单味药大多是人参、黄芪，杂合其他中药又可形成自制方药，有调节细胞免疫，防止心肌细胞受损的重要功效。本实验结果证实，金银花具有明显的体内抑制CVB3作用。进一步印证了金银花对小鼠病毒性心肌炎抑制作用，为临床应用金银花治疗病毒性心肌炎提供理论依据，本研究使用的是金银花单方制剂观察的结果，但对于金银花与其他药物组成的复方制剂对于病毒性心肌炎的效果如何，有待近一步的深入研究。该研究顺应当前临床实践的迫切需要，对于临床应用金银花治疗病毒性心肌炎，具有十分重要的理论意义和应用价值。

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Protective Effect of Honeysuckle on Viral Myocarditis in Mice and Its Mechanism

LOU Xu-sheng1,HU Jing-hong2,GE Dong-yu2,LU Wei-xing1

(1.DepartmentofCardiology,TheThirdHospitalAffiliatedBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.ResearchLaboratoryCenterofTraditionalChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To study the protective effect of honeysuckle on Coxsackie B3 (CVB3) in mice with viral myocarditis. Methods: BALB/c mice were randomly divided into a normal control group,a model group,a low dose group of honeysuckle,a high dose of honeysuckle, with oral administration for three weeks. In each group after CVB3 infection on the 7th,14th and 21st days take histopathological examination of heart,and at the same time respectively by xanthine oxidase method and thiobarbituric acid method measure the serum and myocardial superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content. Compare the measured value in the detection of mice according to muscle activity of SOD and MDA on the 7th 14th and 21st days.Results: In low dose and high dose groups mice activity was significantly higher than that of virus control group,and the content of MDA was significantly lower than that of the virus control group on the 14th and 21st days (P<0.05);in high dose group, low dose group on the twenty-first day the serum SOD activity and MDA content returned to normal; the mice were changed differently on the 7th, 14th and 21st days according to muscle tissue SOD activity and MDA. Inflammatory pathological changes of mice in each experimental group were reduced significantly. Conclusion: Honeysuckle can reduce the damage of oxygen free radicals of CVB3 infection mice,which has a protective effect on the myocardium of VM mice.

Honeysuckle;Viral myocarditis;Coxsackie virus infection;Oxygen free radical；Protective effect;Mechanism

2016-10-15

2016-12-28

北京中医药大学自主选题项目(2011JYBZZJS-030)

娄序笙(1976-),女，硕士研究生，主治医师，研究方向:心血管疾病的中西医治疗的研究。

*通讯作者：鲁卫星(1959-)，男，硕士，主任医师，研究方向:中医气血痰瘀理论在心血管疾病中的应用及中医药防治心血管疾病的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)01-0037-04