咪喹莫特对伴有高危型HPV感染的宫颈尖锐湿疣疗效及HPV DNA含量的影响

余剑琴，胡燕，周强勇，徐云升

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325015，1.妇科；2.皮肤科）

·论 著·

咪喹莫特对伴有高危型HPV感染的宫颈尖锐湿疣疗效及HPV DNA含量的影响

余剑琴1，胡燕1，周强勇1，徐云升2

（温州医科大学附属第一医院，浙江温州 325015，1.妇科；2.皮肤科）

目的：探讨咪喹莫特对伴有高危型HPV感染的宫颈尖锐湿疣（CA）的临床治疗效果及对HPV DNA的影响。方法：选取本院女性宫颈CA伴高危型HPV感染的患者120例，按患者意愿分为治疗组和对照组，每组60例，分别给予5%咪喹莫特局部治疗、高频电刀电灼。比较2组患者疣体脱落、创面愈合情况、痊愈后复发及不良反应情况。同时进行HPV基因测序，并比较治疗前后2组宫颈HPV-DNA病毒载量的差异。结果：治疗后的第4、第8、第12周，治疗组疣体清除率分别为25.0%（13/52）、65.4%（34/52）、84.6%（44/52），对照组疣体清除率分别为30.9%（17/55）、70.9%（39/55）、74.5%（41/55），2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗组痊愈者复发率为10.2%（5/52），对照组复发率为25.5%（14/52），2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。HPV基因测序显示我院妇科门诊宫颈CA合并HPV 16型感染最常见，其次为52型、58型。随访第3、第6个月，治疗组HPV病毒转阴率分别为28.2%（15/52）、59.6%（31/52），相比对照组12.7%（7/55）、27.3%（15/ 55）均显著升高，而治疗组HPV-DNA病毒载量较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：5%咪喹莫特乳膏在清除宫颈CA瘤体的同时，能够有效地预防复发并清除高危型HPV病毒的感染，提示5%咪喹莫特具有治疗及防止宫颈CA复发的作用。

咪喹莫特；宫颈尖锐湿疣；人乳头瘤病毒

人乳头状瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）引起的生殖道感染发病率逐年上升，该病毒的持续性感染与宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌的发生密切相关。尖锐湿疣（condlomaacuminaum，CA）是HPV引起的皮肤黏膜增生疾病，近年来CA发病率迅速上升，现已位居我国性传播疾病的第二位[1]。以外阴CA为首诊的病例中，往往存在同时感染HPV高危亚型以及子宫颈病变的情况。目前对CA治疗以局部理化及药物治疗为主。临床常用的物理治疗包括激光、冷冻等可以达到临床治愈，但不能解决HPV亚临床感染和潜伏感染病灶的存在，使得CA病程较长、病情顽固易复发。药物治疗主要有0.5%鬼臼毒素、50%三氯醋酸、5%咪喹莫特霜。咪喹莫特是一种新型的免疫调节剂，可以刺激机体产生针对感染HPV细胞的免疫应答，诱导产生干扰素（interferon，IFN）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）、白细胞介素（interleukins，IL）等细胞因子而发挥免疫调节作用，最终消除病毒感染，达到治疗CA的目的，预防宫颈上皮内瘤样病变甚至宫颈癌的发生。本研究旨在验证咪喹莫特在清除宫颈HPV持续感染中作用，为预防宫颈癌提供新的思路。

1 资料和方法

1.1 一般资料2010年1月至2012年12月在本院妇科门诊就医的女性CA患者120例，所有病例均符合以下诊断标准：阴道窥器检查见宫颈口扁平状、菜花状、尖峰状、疣状或地毯状增生物，疣体数量不限，单个疣体大小＜1cm，单纯宫颈CA或合并少量外阴CA。全部病例均选为初发患者，皮损活检符合HPV感染的组织病理学变化特点，通过凯普21型（HPV）试剂盒检测，宫颈分泌物检查有高危型HPV感染。排除标准：对所使用药物过敏，伴有糖尿病或严重的心、肝、肾功能损害，妊娠者，伴有其它性病，治疗前4周内使用过免疫调节药物，2周内接受过局部或系统抗病毒治疗，免疫功能低下或长期需要使用免疫调节剂。按患者意愿分为2组：①治疗组：给予5%咪喹莫特（商品名：明欣利迪乳膏，四川明欣药业有限责任公司生产）涂布宫颈疣体表面；②对照组：高频电刀电灼，对宫颈可见疣体及病变周边0.2～0.3cm处组织进行电灼，直至疣体完全消失。分别完成60例，完成随访的例数作为最后统计的例数。其中，治疗组完成52例随访，药物过敏者2例终止治疗，有6例未完成随访。对照组完成55例，有5例未完成随访。所有治疗均经患者知情同意并签署知情同意书。治疗组年龄17～61岁，平均36.5岁，病程最长12个月，最短2d，平均2.7个月；对照组年龄20～56岁，平均34.4岁，病程最长14个月，最短10d，平均3.1个月。各组间的年龄、病程、疣体数目、大小等均具有可比性，见表1。

表1 2组患者一般情况比较（n=60，±s）

表1 2组患者一般情况比较（n=60，±s）

项目治疗组对照组P年龄（岁）36.50±11.3034.40±12.100.681病程（月）2.70±1.003.10±1.200.831疣体数目（颗）2.40±1.302.60±1.300.744疣体大小（cm）0.68±0.180.61±0.210.446

1.2 治疗方法治疗组患者均取膀胱截石位，术前用聚维酮碘液消毒外阴阴道及宫颈，用蘸有5%咪喹莫特乳膏的带尾纱棉球放置宫颈疣体处，8～10h取出，温水局部冲洗，每周3次，1周为1疗程，反复使用4个疗程。用药结束后进行疗效判定和随访观察。对照组以高频电刀电灼切除宫颈疣体，对宫颈可见疣体及病变周边0.2～0.3cm处组织进行1次电灼，待4周创面愈合后进行疗效判定和随访。

1.3 随访在治疗开始后4、8、12周复查1次，观察疣体脱落，创面愈合情况及不良反应，对痊愈患者观察复发情况。检测治疗开始前及治疗结束后3、6个月HPV基因测序及HPV-DNA病毒载量。

1.4 临床疗效判定治愈：治疗开始后1个月，疣体完全脱落，创面愈合良好；无效：治疗开始后1个月，疣体不能完全脱落。对治愈患者在治疗开始后1、3、6月进行随访，观察复发情况。未复发：在随访的3个月内，宫颈未见新生疣体，原皮损处醋酸白试验阴性；复发：在随访的3个月内，无再次感染情况下，原皮损处或周围出现新疣体。

1.5 HPV基因型别检测21种HPV分型检测试剂盒购于广东凯普生物科技股份有限公司，先以窥阴器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去。取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4～5圈以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好样本标识，保持洗脱管直立放置。计算好各扩增试剂的使用量，加入适当体积置离心管中。充分混合均匀，2000r/min离心10s。向设定的PCR反应管中分别加入15μL，转移至样本处理区。轻微振荡悬浮起保存液中的脱落细胞，确保细胞均匀悬浮起来。取50μL保存液于1.5mL离心管中，如果有颗粒状物体（疣体）确保有一部分取入离心管。12000r/min离心3min，小心取上清并丢弃。加入200μL标本提取液，振荡混匀，将离心管放入100℃水浴10min。12000r/min离心5min。保留上清以备检测。向所设定的PCR反应管中分别加入处理过的样本5μL，盖紧管盖，PCR反应管转移至传递窗，记录样本摆放顺序。PCR扩增检测根据需要反应的数量裁剪反应板，在每孔中加入微球杂交液22μL。在每孔中加入PCR产物3μL，依次按顺序加样，加样顺序和扩增时的顺序保持一致，避免误差。

1.6 HPV-DNA病毒载量检测采用美国Digene公司制造的杂交捕获2代（HC2）基因杂交信号放大系统测定试剂盒，购于上海莱特公司。具体步骤为：标记杂交板，准备变性试剂。吸取变性试剂（样本体积的1/2）至质控和样本，确保所有的管都呈现紫色。用膜把盖封住。振荡10min。在（65±2）℃下，孵育（45±5）min。准备HPV探针混合物。充分混合变性样本，吸取75μL至微孔板的孔中。在20～25℃下，孵育10min。吸取25μL高危型HPV探针混合物至微孔板孔中。盖住管盖，在（1100±100）r/min的振荡器上振荡（3±2）min，确保所有的管都变黄色。在（65±2）℃下，孵育（60±5）min，准备捕获微孔板。把管中的成分转到捕获微孔板上，用盖或膜封住。在20～25℃下，在（1100±100）r/min振荡孵育（60±5）min。准备洗涤缓冲液，倒掉板上的成分。在捕获微孔板上的每个孔中加入75μL检测

试剂1，盖住孔板，在20～25℃下孵育30～40min。然后洗涤板，将板放在洗板机上，按“开始/停止”键，启动洗涤。吸取75μL的检测试剂2至捕获微孔板的每个孔中，在20～25℃下孵育15～30min。捕获微孔板在化学发光仪上读数，分析临床验证方法并解释样本结果。

1.7 统计学处理方法采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，2组计量资料采用独立样本t检验，2组计数资料率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈CA疣体清除率及疣体复发率在初次就诊、治疗的第4、第8、第12周，治疗组疣体清除病例分别为13例（占25.0%）、34例（占65.4%）、44例（占84.6%）；痊愈者复发5例，复发率达10.2%。患者在治疗过程中，出现流感样不适1例，未经处理后自行恢复。对照组经高频电刀电灼治疗后第4、第8、第12周，疣体清除病例分别为17例（占30.9%）、39例（占70.9%）、41例（占74.5%）；痊愈者复发14例，复发率达25.5%。2组比较，疣体清除率比较差异无统计学意义[χ2=0.463（4周），χ2=0.376（8周），χ2=1.659（12周），P＞0.05]；复发率间比较差异有统计学意义（χ2=4.592，P＜0.05）。

2.2 宫颈CA治疗后病毒转阴率在初次就诊、治疗的第1、第3、第6月，治疗组病毒转阴病例分别为6例（占11.5%），15例（占28.8%），31例（占59.6%），对照组病毒转阴病例分别为3例（占5.4%），7例（占12.7%），15例（占27.3%）。2组比较，随访1个月病毒转阴率差异无统计学意义（χ2=0.616，P＞0.05），随访3个月病毒转阴率（χ2=4.252，P＜0.05），随访6个月病毒转阴率间比较差异有统计学意义（χ2=6.683，P＜0.05）。

2.3 宫颈CA病例HPV高危基因型别分布治疗前入选病例HPV基因分型，经凯普21种（HPV）分型检测，结果显示本院妇科门诊宫颈CA混合HPV高危型病毒感染病例共107例，其中HPV16型（22/107）最常见，其次为52型（21/107）、58型（15/107）。

2.4 HC2检测HPV-DNA病毒载量治疗组与对照组初始病例间HPV-DNA病毒载量差异无统计学意义（P＞0.05）。经5%咪喹莫特治疗4周后随访发现，治疗后1个月HPV病毒载量下降与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），治疗后3、6个月HPV病毒载量下降差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 2组HPV-DNA病毒载量的比较（±s）

表2 2组HPV-DNA病毒载量的比较（±s）

时间治疗组对照组P治疗前427.9±196.1414.1±172.80.699 1个月375.1±172.9376.5±157.10.964 3个月224.5±106.5326.5±135.50.000 6个月147.8±73.0238.3±100.80.000

2.5 不良反应治疗组局部不良反应发生率为50%，其反应主要为局部刺激症状，包括红斑、糜烂、水肿、灼热、刺痛等。其中最多为轻度红斑，一般不需要特殊处理。治疗组在1周后出现下列1种或数种反应：红斑10例、烧灼感9例、局部水肿4例、局部糜烂2例、发热及流感样症状1例，随着治疗时间的延长，不良反应逐渐减少且程度减轻，本组无1例因不能耐受而退出治疗。对照组中有患者偶有阴道少量流血，不影响治疗。

3 讨论

作为易于复发性病的一种，CA的治疗方法非常多，包括化学方法如使用化学腐蚀剂鬼臼毒素，物理方法如光动力、激光或高频电刀治疗等[2]，上述方法尽管一定程度上能清除疣体，但仍然存在较高的复发率，其复发率高达30%～70%。目前认为该病易复发的原因主要是HPV潜伏感染、亚临床感染的存在，以及病毒的再活动和局部细胞免疫功能低下[3]。这就提示我们进行CA的治疗时，一方面要控制病灶部位的病毒，另一方面可以针对病灶部位进行免疫调节。为防止CA复发并提高治愈率，临床上常采用系统或局部注射胸腺肽、IFN、IL-2等非特异性免疫调节剂的方法，但效果并不理想。近年来随着对CA患者免疫功能低下机理的深入了解及基因工程技术的发展，不断有新的免疫调节剂应用于CA的治疗，并收到了较好的疗效。

本研究的咪喹莫特是一种人工合成的咪唑喹啉胺类衍生物，已进行的人体及动物试验均表明该药具有强大的抗病毒、抗肿瘤活性。这种抗肿瘤、抗病毒的能力并不是直接的而是通过诱导机体角质形成细胞产生TNF-α、IFN-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等细胞因子发挥作用[4]。IFN-α还能诱导2，5’寡腺苷酸合成酶，从而引起含病毒的细胞凋亡[5]。KONO等[6]通过细胞培养实验发现，咪喹莫特可使人皮肤角质形成细胞内编码IL-6、IL-8细胞因子的mRNA表达水平明显升高。TYRING等[7]通过人体实验观察咪喹莫特的局部作用，结果显示CA患者的疣体清除率与用药部位皮肤内编码IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-2mRNA的表达水平呈正相关，而与HPV-DNA的表达水平呈负相关。至此，咪喹莫特的作用机制在于对多种细胞因子的诱生作用，但具体作用于何种细胞尚未明确。另外，TYRING等[8]的研究发现，局部外用咪喹莫特除了可以在局部诱生TNF-α、IFN-α、IFN-γ外，局部皮肤细胞内编码CD4和CD8的mRNA表达水平也明显升高，提示咪喹莫特的作用机制是对Th1细胞介导的细胞免疫应答（而非体液免疫应答）产生间接促进作用。

咪喹莫特作为一种外用乳膏，使用方法简便，患者容易接受，可在家中自行使用。本次临床观察表明咪喹莫特乳膏是一种较为有效、安全的方法，且能明显降低该病的复发率。国内近年来已有报道外用治疗CA亦取得了较好的疗效[9]。EDWARDS等[10]和BEUTNER等[11]的临床研究均表明5%咪喹莫特霜剂用于治疗CA疗效良好，复发率也不高。最近，VILATA等[12]报道了西班牙101个诊所中用5%咪喹莫特霜治疗生殖器和肛周疣的情况（共550例），认为使用咪喹莫特治疗生殖器和肛周疣，患者有较大的满意度和较高的依从性。DIAZ-ARRASTIA等[13]的研究发现，5%咪喹莫特乳膏应用于宫颈上皮内瘤变的治疗也获得良好的疗效。局部应用咪喹莫特刺激局部病灶产生针对HPV感染的免疫应答，最终清除病毒从而治疗CA的方法已成为近来国内外研究的热点[14]。但是，咪喹莫特乳膏使用时亦有一定的自限性[15]，具体表现在对皮损总体面积小、单个体积较小或肉眼难以分辨的皮损效果较好，而对总体面积大、单个体积较大或数目较多，尤其是角化过度的皮损，效果较差。

本研究发现，52例治疗组宫颈CA经5%咪喹莫特乳膏治疗后宫颈分泌物检测HPV-DNA拷贝数显著下降，与治疗前相比差异有统计学意义，且与对照组相比差异也有统计学意义。经过4周治疗后随访发现，治疗组疣体病毒转阴率与对照组相比差异有统计学意义，提示5%咪喹莫特对HPV具有良好的清除作用。由此可见，5%咪喹莫特有治疗及防止宫颈CA复发的作用，为进一步将其应用于临床清除宫颈HPV持续感染及相关宫颈病变提供了新的思路。

[1] 张学军. 皮肤性病学[M]. 6版, 北京: 人民卫生出版社, 2004: 220-221.

[2] CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines[R]. MMWR, 2006, 55∶ RR-11.

[3] 徐文严. 性传播疾病预防与治疗[M]. 上海: 第二军医大学出版社, 2001: 3-5.

[4] TRAN H, MORENO G, SHRMACK S. Imiquimod as a dermatological therapy[J]. Expert Opin Pharmacother, 2004, 5(2)∶ 427-438.

[5] SAUDER D N. Immunomodulatory and pharmacologic properties of imiquimod[J]. J Am Acad Dermatol, 2000, 43(1)∶ 6- 11.

[6] KONO T, KONDO S, PASTORE S, et al. Effects of a novel topical immunomodulator, imiquimod, onkeratinocyte cytokine gene expression[J]. Lymphokine Cytokine Res, 1994, 13(2)∶ 71-76.

[7] TYRING S K, ARANY I, STANLEY M A, et al. Aran-domized, controlled, molecular study of condylomata acuminata clearance during treatment with imiquimod[J]. J Infect Dis, 1998, 178(2)∶ 551-555.

[8] TYRING S K, ARANY I, STANLEY M A, et al. Mechanism of action of imiquimod 5% cream in the treatment of anogenital warts[J]. Prim Care Update Ob Gyns, 1998, 5(4)∶151-152.

[9] 陶苏江, 顾军, 赵广, 等. 5%咪喹莫特乳膏治疗尖锐湿疣的临床研究[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2006, 20(3): 147-148.

[10] EDWARDS L, FERENCZY A, ERON L, et al. Self-administered topical 5% imiquimod cream for external anogenital warts. HPV study group. Human Paplilomavirus[J]. Arch Dermatol, 1998, 134 (1)∶ 25-30.

[11] BEUTNER K R, SPRUANCE S L, HOUGHAM A J, et al. Treatment of genital warts with an immune-response modifer (imiquimod)[J]. J Am Acad Dermatol, 1998, 38 (2Pt 1)∶ 230-239.

[12] VILATA J J, SIERRA X. Effcacy of imiquimod 5% cream in treating genital and perianal warts[J]. Ann Dermatol Venereol, 2002, 129∶ S322.

[13] DIAZ-ARRASTIA C, ARANY I, ROBAZETTI S C, et al. Clinical and molecular responses in high- grade intraepithelial neoplasia treated with topical imiquimod 5%[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7(10)∶ 3031-3033.

[14] 钱伊弘, 王学民. 循证医学方法评价干扰素治疗尖锐湿疣[J]. 临床皮肤科杂志, 2003, 22(3): 139-140.

[15] SAUDER D N, SKINNER R B, FOX T L, et al. Topical imiquimod 5% cream as an effective treatment for external genital and perianal warts in different patient populations[J]. Sex Transm Dis, 2003, 30(2)∶ 124-128.

（本文编辑：吴昔昔）

Effect of imiquimod on cervical condyloma acuminate accompanied with high-risk HPV infections and the content of HPV DNA

YU Jianqin1, HU Yan1, ZHOU Qiangyong1, XU Yunsheng1. 1.Department of Gynecol-

ogy, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Dermatology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To explore the effect of imiquimod on cervical condyloma acuminate accompanied with high-risk HPV infections, and the content of HPV-DNA.Methods:One hundred and twenty female patients with cervical condyloma acuminate and high-risk HPV infections were randomly divided into treatment goup and control group, and each group was administered either 5% imiquimod local treatment or high frequency cauterization. The dropping of verrucous, wound healing, recurrence and adverse reactions between the two groups were analyzed. HPV gene sequencing was conducted, and the viral load of HPV-DNA was compared before and after treatment between the two groups.Results:At 4, 8, 12 weeks after treatment, the clearance rate of verrucous were 25.0% (13/52), 65.4% (34/52), and 84.6% (44/52) in the treatment group, respectively. Meanwhile, the clearance rate of verrucous were 30.9% (17/55), 70.9% (39/55), and 74.5% (41/55), respectively. There were no signifcant differences between two groups (P＞0.05). The recurrence rate was 10.2% (5/52) in the treatment group, which was signifcantly lower compared to the control group (P＜0.05). HPV gene sequencing showed that HPV type 16 was most common in cervical condyloma acuminate in our hospital, followed by type 52 and 58. After 3 and 6 months follow-up, HPV negative conversion rate in treatment group was 28.2% (15/52) and 59.6% (31/52), and statistically signifcant over that of 12.7% (7/55) and 27.3% (15/55) in the control group. Besides, the viral load of HPV-DNA in the treatment group was signifcantly lower compared to the control group (P＜0.05).Conclusion:5% imiquimod can remove verrucous of cervical condyloma acuminate and additionally prevent recurrence and cure high-risk HPV. This result shows that 5% imiquimod is effective in the treatment and the prevention of relapse cervical condyloma acuminate.

imiquimod; cervical condyloma acuminate; human papillomavirus

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.006

2016-04-15

温州市科技计划项目（Y20090119）；浙江省医药卫生科技计划项目（2011KYA107）。

余剑琴（1975-），女，浙江温州人，主治医师，硕士。