肾缺血再灌注损伤中蛋白激酶C对巨噬细胞的影响

肖婷综述容松审校

（遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563003）

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肾缺血再灌注损伤中蛋白激酶C对巨噬细胞的影响

肖婷综述容松审校

（遵义医学院附属医院肾内科，贵州遵义563003）

缺血再灌注损伤是器官移植不可避免的反应过程，其病理生理机制包括细胞凋亡、氧自由基生成、免疫系统活化、微血管功能障碍等。其中先天免疫是机体防御的第一道防线，也是关键环节，而巨噬细胞是肾脏缺血性先天免疫早期重要的起动子，在缺血再灌注损伤中发挥双剑作用。因此，在早期减轻巨噬细胞的浸润是目前的研究热点。而蛋白激酶C抑制剂能通过多途径作用减少移植肾内的巨噬细胞浸润，但目前具体机制尚不完全清楚。

肾缺血再灌注损伤；先天免疫；巨噬细胞；蛋白激酶C

缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是指组织器官缺血再灌注后其组织细胞代谢障碍，从而导致结构和功能的破坏，是器官移植后不可避免的反应过程，也是移植物失功的主要病理机制，因此如何减轻这种损伤一直是器官移植研究的热点，也是难点。IRI的病理生理机制复杂，影响因素包括能量代谢障碍、胞内线粒体及胞膜改变、不同形式的细胞死亡、趋化因子、细胞因子等促进炎症反应发生并导致免疫系统活化，而炎症的持续存在最终导致移植物进行性纤维化[1]。有观点认为先天免疫反应是IRI的关键部分[2]，了解先天免疫反应及器官移植后同种免疫反应是优化移植物长期结果的关键[3]。而巨噬细胞在肾脏缺血再灌注损伤的固有免疫及获得性免疫中都拥有重要作用[4]。目前认为巨噬细胞至少有两种表型：经典活化M1型参与促炎反应，选择性活化M2型参与抗炎反应[5]。因此在损伤早期减少巨噬细胞浸润，能减轻移植物损伤。查阅相关文献及本实验小组前期实验均发现，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制剂能阻止巨噬细胞向肾间质浸润，并进一步深入研究发现PKCβ及ε缺失对单核巨噬细胞早期浸润有阻碍作用[6-7]。但其具体作用机制及是通过巨噬细胞何种亚型对肾损伤产生保护作用尚不明确，有待进一步研究。本文主要将探讨PKC对巨噬细胞影响。

1 缺血再灌注损伤的病理生理机制概述

缺血再灌注损伤主要由器官血流动力学受损引起。目前我国器官移植大部分供体来源于尸体，早在供体脑死亡时就已经发生血流动力学紊乱，随后的器官采集、冷储藏等都将引起器官缺血，从而导致组织缺氧、能量代谢障碍，乳酸堆积、胞内ATP消耗，Na+-K+ATP酶失活，水钠潴留，细胞肿胀、溶酶体膜破裂、细胞坏死[2]；同时也导致Ca2+泵失活、钙超载[8]，钙依赖的蛋白激酶如钙激活中性蛋白酶活化。但奇怪的是再灌注后，血流恢复并没有使之前受损的细胞得到改善，反而加重细胞损伤。可能与再灌注后活性氧(ROS)生成、线粒体失功、内皮功能障碍和免疫系统活化有关。再灌注后线粒体复合物受损，导致过度活性氧生成并超出抗氧化清除能力[9]。反过来，活性氧破坏膜脂质、蛋白质和核酸导致细胞死亡[10]。此外，线粒体渗透性转换孔(mPTP)接触活性氧后开放并引起线粒体钙增加，导致电化学梯度的中断，解耦联氧化磷酸化和ATP耗竭，渗透压增加、线粒体肿胀、膜破裂导致细胞坏死、凋亡[11]。死亡的细胞刺激免疫系统活化，从而介导中性粒细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞等活化并浸入组织释放炎症因子，同时模式识别受体(pattern recognition Receptors，PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)、补体系统激活产生级联放大效应，诱导移植物失功[1]。

移植物脉管系统对缺血再灌注损伤也十分敏感[12]，事实上再灌注后缺血组织血流量并不是立即完全恢复，这个过程称为“无复流现象”，主要由于肾缺血缺氧后血管紧张素[13]、内皮素等缩血管物质生成增加，内皮细胞肿胀及白细胞、纤维蛋白、血小板等在血管内粘附聚集有关。在IRI中，受损活化的内皮细胞也失去了屏障功能，渗透性增加、白细胞迁移[14]。此外，血液流动停止已被证明由于KLF2的减少会导致内皮功能损伤[15]。

最近有研究证实，在IRI期间补体系统经典及凝集素活化途径均主要发生在内皮细胞层[16]，补体系统的启动及Akt(serine/threonine-specific protein kinase)途径活化使得内皮细胞获得间叶细胞表型，诱导间质纤维化并促进慢性肾脏病的发展[17-18]。

2 巨噬细胞在肾缺血再灌注损伤中的双剑作用

缺血再灌注所致损伤主要有两个阶段：第一阶段在器官移植后迅速发生，与缺血相关性损伤有关；第二阶段发生时间相对较晚，与IRI所致免疫系统活化并引起抗体介导和细胞介导的排斥反应有关。而树突细胞和巨噬细胞是肾脏先天免疫早期重要的起动子，也衔接了炎症后缺血再灌注损伤的发生[4]。它们是肾脏中最丰富的白细胞，能在再灌注后直接通过促炎因子及其他可溶性炎症介质调节因子的产生或直接通过效应T淋巴细胞和自然杀伤T细胞诱导炎症反应[4]。有研究显示在再灌注30 min内即有中性粒细胞和巨噬细胞进入肾脏，24～48 h内达高峰[4]。通过免疫组织化学染色法检测到在同种异体移植物排斥反应中，巨噬细胞占浸润白细胞的38%～60%[19]。

巨噬细胞有两种主要表型:经典活化M1型和选择性活化M2型。再灌注24 h后巨噬细胞浸润明显增加[20]。在INF-γ及TNF-α诱导下其表型主要表现为M1型，激活后的M1型巨噬细胞促进IL-1、IL-6、IL-23等促炎因子产生，导致炎症反应及组织损伤[21]；同时高表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，iNOS分解精氨酸为瓜氨酸和一氧化氮(NO)，大量生成的NO引起组织损伤[22]。同时M1型巨噬细胞能在IL-6及IL-23刺激下活化辅助性T细胞17(Th17)[21]，Th17是一种新发现的能够分泌IL-17的T细胞亚群，而IL-17可以促进T细胞激活并刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生多种细胞因子从而导致炎症的产生。

当巨噬细胞受IL-4诱导时表型转换为M2型。IL-4或者IL-13通过与其受体IL-14Rα结合激活JAK-STAT6转导通路[23-24]，调节M2效应子如精氨酸酶-1(Arg-1)等表达上调，而精氨酸酶能与iNOS竞争性结合精氨酸，裂解精氨酸为多胺和脯氨酸，促进细胞分裂和胶原形成，对炎症后期造成的组织损伤进行修复和重塑[25]。同时M2型巨噬细胞也能通过IL-4/ IL-13刺激诱导产生甘露糖受体(MMR)及IL-10[26]。MMR属C型凝集素超家族中多糖识别域家族成员，在天然免疫防御发挥重要作用，同时参与抗原提呈、诱导并调控获得性免疫应答。

3 蛋白激酶C对大鼠巨噬细胞的影响

3.1 蛋白激酶C概述PKC是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族主要成员，它与蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase，PKG)共同构成丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AGC(PKA、PKG和PKC)超家族。PKC包括至少10个同工酶(原认为12个)[PKCα、βI、βII、γ、δ、ε、η(L)、θ及ζ和λ]，由单一多肽链组成，其结构由高度同源性的4个保守区(C1～C4)和低度同源性的5个可变区(V1～V5)组成，可变区在特定PKC同工酶亚型的识别和激活中起作用。正常情况下PKC处于非活化状态，其依赖于Ca2+、乙酰基甘油、磷脂酰丝氨酸或其类似物佛波酯刺激而激活，催化蛋白质内丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，从而进行信息传导，是细胞肌醇磷脂信号通路的关键环节，在细胞迁移、增殖、凋亡和离子通道调制上均起着重要的作用[27]。其在各组织、器官中均有广泛表达，在肾脏中表达也非常广泛，有大量研究表明同工酶α、βI、δ、ε、ζ、λ均能在肾脏中检测到(PKCβII主要表达于肾间质细胞)[28]，并参与调控肾小球的血流动力学[29]及肾小管[30]、集合管的转运机制[31-32]。

3.2 蛋白激酶C与巨噬细胞国内外相关文献及实验研究结果，表明PKCβ抑制剂能减少巨噬细胞浸润，从而达到肾保护效应。本课题小组的前期实验也证实了此观点，并进一步研究发现PKCβ缺失对单核巨噬细胞早期浸润有阻碍作用[7]。

有报道在缺血缺氧条件下脂代谢受到阻碍，总胆固醇、二酰甘油增加[33]，增加的二酰甘油刺激PKC活化增加。而激活的PKC能在GM-CSF及IL-4的诱导下刺激CD14+单核细胞分别向巨噬细胞/树突细胞分化[34]，并与单核细胞初始粘附于血管壁和纤维蛋白原有关，而单核细胞粘附于内皮细胞是血管损伤的第一步。另有研究显示，巨噬细胞在趋化因子如MCP-1等的趋化下进入肾间质，从而引起小管间质损伤，而骨桥蛋白介导这一趋化作用，PKC则介导骨桥蛋白表达[35]。Lin等[34]的研究已经证实在高糖条件下微血管系统中主要活化的是PKCβ，而PKCβ抑制剂能阻止单核细胞向内皮细胞粘附，显著改善糖尿病微血管并发症。同样Kelly等[35]发现在高糖条件下PKCβ抑制剂也能减少骨桥蛋白的表达，同时能降低MCP-1、ED-1表达[36]，从而抑制巨噬细胞及其他炎性细胞浸润。另有报道发现巨噬细胞暴露于细菌脂多糖(LPS)时活化PKC，而用各种PKC同工酶抑制剂证实PKC是巨噬细胞许多功能(如IL-1、TNF-α、NO产生及抗肿瘤细胞活性)所必须的，并进一步研究发现主要是PKCβI及βII的活化促进了巨噬细胞中LPS诱导的细胞毒性作用和一氧化氮产生[37]。而Picinich等[38]的实验表明IL-8信号通路可激活PKC，应用PKC抑制剂可以明显抑制IL-8的表达[39]，IL-8主要由巨噬细胞和上皮细胞分泌，是一个非常重要的炎症趋化因子。

综上所述，PKC抑制剂对巨噬细胞的影响主要有几个方面：①阻止单核细胞向巨噬细胞分化；②阻止巨噬细胞粘附于血管壁，从而减轻血管损伤；③减少趋化因子表达，从而减少巨噬细胞向阻止浸润；④降低IL-8等巨噬细胞分泌的炎性因子的表达；⑤直接抑制巨噬细胞诱导的细胞毒性作用。

4 展望

在过去的20年里，已经有大量研究表明在进行性的肾损伤中巨噬细胞起着关键作用，在肾缺血再灌注损伤中也不例外。巨噬细胞主要有两种表型：经典促炎M1型及抗炎M2型。其中M1型的主要损伤机制包括启动免疫应答、释放氧自由基、炎症因子及包括TGF-β1在内的生长因子，其中TGF-β是肾纤维化的关键致病因子之一；而M2型主要产生精氨酸酶-1、甘露糖受体及胰岛素样生长因子等，从而促进损伤组织修复。因此，在损伤早期阻止单核巨噬细胞浸润能显著改善损伤组织。研究发现PKC在促进单核细胞向巨噬细胞分化，并介导其粘附于血管壁及浸润肾间质中均发挥不小的作用，同时Wang等[40]研究发现PKC(主要是βI、βII)高表达能上调TGF-β及血管内皮生长因子(VEGF)的表达从而诱导肾间质纤维化，而使用PKCβ抑制剂能阻止单核巨噬细胞的浸润并下调TGF-β表达，从而达到肾保护效应；这为移植后缺血再灌注损伤的治疗提供了新的思路。但其对巨噬细胞的具体影响机制还有待进一步研究。

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Influence of protein kinase C on macrophages in renal ischemia-reperfusion injury.

XIAO Ting,RONG Song. Department of Nephrology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,CHINA

Ischemia-reperfusion injury(IRI)is inevitable for organ transplantation,and its pathophysiological mechanisms include apoptosis,generation of reactive oxygen species(ROS),innate immune system activation,microvascular dysfunction.The innate immune system is the first line of defense,also a critical component of organ transplantation.Macrophages are the critical early initiator of innate immunity in the kidney,which play a dual role in renal ischemia-reperfusion injury.Therefore,how to reduce macrophage infiltration is a hotspot of ischemia-reperfusion injury. Protein kinase C inhibitors can reduce macrophage infiltrate in the renal allografts through multiple pathways,but how it works is still unclear.

Renal ischemia-reperfusion injury(IRI);Innate immune system;Macrophage;Protein kinase C (PKC)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.034

R692

A

1003—6350（2017）08—1302—04

2016-08-17)

国家自然科学基金（编号：81160096）

容松。E-mail：songrong@hotmail.com