奶牛乳腺免疫学研究进展

刘燕霏，杨建德

近年来我国奶牛业有了长足的发展，已成为畜牧业的重要组成部分。制约我国奶业发展的因素有奶牛品种、饲草饲料结构、原奶质量及饲养管理水平等。主要因素涉及养殖工艺粗放，优质饲草匮乏，疫病防制体系薄弱，乳品加工技术落后，牛奶质量监控体系不健全等诸多方面。奶牛乳房炎是奶牛乳腺组织的炎症，是一个世界性难题，它的发生和奶牛遗传因素、病原微生物、环境因素及管理因素等密切相关[1-2]。乳房炎是奶牛最为常见，也是造成奶牛饲养经济损失最严重的疾病之一，可直接影响奶汁品质，导致产奶量下降，乳汁稀薄，品质降低，造成奶牛业较大的经济损失。如何控制奶牛乳房炎是摆在全球各国专家面前的课题。研究和预防奶牛乳房炎涉及遗传、病原微生物及环境管理等诸多方面，本文结合近些年这方面的文献，重点阐述乳腺的结构与免疫学在控制乳房炎方面的作用机制。

1 奶牛乳腺组织结构

不同品种的奶牛，乳房大小可存在差异。乳房的左右两部分被中间韧带隔开，而前后两部分被分隔得更加明显。奶牛乳房一般由4个乳区构成，一个乳区中产生乳汁不能转移到另外一个乳区中。每个乳区对应一个乳头，每个区包括乳腺分泌细胞、腺泡、乳导管、乳池等[3]。乳腺由泌乳组织和结缔组织组成。泌乳组织的数量，即泌乳细胞的数量，是制约产奶能力的因素之一，但是乳房的大小并不一定和产奶量成正比，因为乳房除乳腺外，还可能存在有大量的结缔组织。泌乳细胞呈单层排列，位于类似于气泡的球形结构的基膜上，气泡直径约为50～250 mm，多个气泡就可以组成类似于肺泡的小叶结构。合成的乳汁储存在气泡、泌乳管、乳房和乳池中。乳头由乳池和乳导管组成，乳池和乳导管汇合处有6～10条纵向的褶皱形成所谓的病原体屏障（称之为Furstenberg’s rosette）来抵御病原菌的入侵。乳导管由很多纵向或环状的平滑肌纤维包围，平滑肌纤维的作用是保证非挤奶期间乳导管处于关闭状态，乳导管带有角蛋白也能起到免受病原体细菌感染的作用。乳腺特别是乳头上有密集的神经末梢，对幼崽的吮吸或接触等比较敏感。乳房也有神经组织，这些神经组织与血液循环系统和乳导管的平滑肌相连，但是没有直接控制泌乳组织的神经。乳腺有密集的动脉和静脉系统，不断地为细胞提供合成乳汁的养分。每1 L牛奶需要流过乳房的血液约为500 L，乳房淋巴系统负责清除外来杂质残留，也可启动免疫反应来防止细菌感染[4-6]。

2 固有免疫

2.1 屏障结构

乳腺组织因具有独特的生理构造，起到抗感染保护作用。乳头管括约肌和乳头管内上皮细胞分泌的角蛋白能阻止病原菌粘附在上皮细胞表面，还可分泌抗菌活性的蛋白质和有机酸类，如棕榈酸、豆蔻酸、亚油酸等脂肪酸具有抗菌作用，因而构成了乳腺抗感染的第一道防线[2]。同时，乳头管周围括约肌在挤奶间隔期处于收缩状态，可防止病原菌入侵，并在挤奶时将乳头管内角蛋白上的病原菌固定在局部，在挤奶时随角质层脱落被挤出。

2.2 乳汁中抗微生物物质

乳汁中含有的补体蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白和乳过氧化物酶系统等抗菌活性物质发挥保护乳腺和维持乳腺功能的重要作用。

补体是存在于血清和乳汁当中具有酶活性的一组不耐热的蛋白质，主要由肝细胞、单核细胞或组织中的巨噬细胞等合成。一些病原微生物成分可直接激活补体替代途径，达到溶解病原微生物的目的。此外补体还可以起到调理作用及介导炎症反应，补体活化后释放的小片段可吸引吞噬细胞抵达感染部位。在抵抗大肠杆菌性乳房炎的炎症中，补体发挥重要作用[7]。补体在健康乳汁中浓度含量较低，而炎性乳汁中补体浓度大幅提高，来共同对付入侵微生物。

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。有研究报道，采用溶酶体转基因到奶山羊乳腺能明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长速度[8]，溶菌酶含量在临床型乳房炎乳样中可高达15.6 mg/mL，在亚临床乳房炎乳样中含量为11.2 mg/mL，而健康奶样中含量为6.9 mg/mL[9]，这表明乳汁中溶菌酶含量与乳腺炎症有关。

1939年，Sorensen等人在分离乳清蛋白时得到一种红色蛋白，但至1959年Groves用色谱得到纯的红色物质后，才确认这种红色物质是一种与铁结合的糖蛋白，称之为乳铁蛋白 （lactoferrin，LF）。LF是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白，其分子量为80 kDa，主要由乳腺上皮细胞和白细胞表达和分泌。LF有效抑制大肠杆菌和沙门氏菌等需铁性革兰氏阴性菌及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的生长繁殖[5]。LF不仅参与铁的转运，而且具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能。Barreto等证实，奶牛LF能够降低肠炎沙门氏菌对Hep-2细胞的侵袭。泌乳期LF含量低于干奶期和炎症期，在干奶期阻止大肠杆菌侵染，起到防御作用[7]。

乳过氧化物酶（Lactoperoxidase，LP）是乳汁中抵抗病原菌的过氧化物酶，免疫学上与哺乳动物血红素有关。LP也存在于哺乳动物的泪液和唾液中，对许多病原菌具有杀灭作用。这种酶依赖于过氧化氢（H2O2）和硫氰酸盐（SCN）发挥作用。LP在过氧化氢作用下，催化的硫氰酸盐（SCN-）转换形成氧化硫氰酸盐（OSCN）。OSCN是硫氰酸盐的主要中间氧化产物，它是LP抗菌成分。LP与SCN-和OSCN合称为LP系统（LP-S），LP-S是乳汁中天然的抵抗微生物物质，可杀灭存在于乳汁的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等[5，7]。

2.3 细胞因子

在正常和乳房炎奶牛乳腺中，细胞因子微妙和敏感的变化可能促进其在乳房的健康预后诊断中的应用。有些学者推测，检测细胞因子可能成为乳房健康的重要指标。随着人们对牛乳腺细胞因子网络和有效细胞因子诊断技术认识的深入，细胞因子的免疫治疗、诊断乳腺炎的作用会进一步显现。

目前，有多种乳腺细胞因子参与炎症反应，如白细胞介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）和IL-6等。研究证实，乳腺内注射的IL-2诱导血液中嗜中性粒细胞迁移至乳汁而导致乳汁中体细胞数升高；还可加速干奶期乳腺组织退化，增加IgG的局部合成能力，增强CD8+T细胞的细胞毒性，降低乳房内感染；临近分娩期和初乳中IL-2的活性较低，使分娩前后乳房炎的发病率大幅提高。IFN-γ是由T细胞与分裂素或抗原在免疫识别应答过程中起着重要的免疫调节作用。IFN-γ可增强乳腺吞噬细胞的生物学活性，进而有效控制乳腺炎的发生。研究发现，IFN-γ对实验性大肠杆菌型乳房炎治疗有效，单独使用γ-干扰素或乳酸环丙沙星均对金黄色葡萄球菌型临床乳房炎有作用，二者配合效果更好[7，9-10]。TNF-α在急性炎症过程中产生，特别是大肠杆菌引起的严重乳腺炎乳汁和血清中表达水平很高，原因可能是由于应激引起TNF大量产生，进入微循环对血管内皮细胞造成损害。TNF-α能增强部分抗生素杀伤金黄色葡萄球菌的能力，可用作抗生素的辅佐治疗剂。CSF在细胞增殖和分化中起着重要作用。粒细胞-巨噬细CSF（GM-CSF）可预防乳腺内的新型感染以及增强粒细胞的趋化性和巨噬细胞的吞噬作用。Takahashi等发现，重组GM-CSF在治疗金黄色葡萄球菌亚临床型乳房炎方面具有很大潜力[11]。临床型乳房炎乳样IL-6含量可高达18 ng/mL，亚临床乳样含量为30.8 ng/mL，而健康奶样IL-6含量为5.2 ng/mL[12]，这表明IL-6在临床和亚临床乳房炎中可能起一定的作用。

3 适应性免疫

3.1 细胞免疫

乳腺内部的细胞免疫防御功能广义地讲包括T细胞、巨噬细胞、NK细胞等发挥的作用。 巨噬细胞主要通过蛋白酶和活性氧吞噬和杀伤病原微生物，来维持乳腺和乳汁健康。当病原菌侵入乳腺后，乳腺巨噬细胞主要释放前列腺素、白三烯和细胞因子等化学物质，吸引大量多核巨细胞（PMN）进入感染部位，加剧炎性反应并中和毒性产物，同时在乳区周围吞噬和消化病原菌，减少病原菌数量[4-5]。

特异性T细胞包括 CD4＋、CD8＋T细胞和γδT淋巴细胞。虽然T细胞进入乳腺是母牛对抗乳房内入侵病原体的关键，但是何种淋巴细胞亚群起作用仍有待于研究。乳腺发生炎症时，外周血中的 CD4＋T细胞占主导地位，激活其他细胞如巨噬细胞或B细胞参与免疫反应，血液中分泌修复受感染部分生长因子的 γδT细胞数量增加。但在金黄色葡萄球菌引起慢性感染的乳腺中，CD8＋T数量大于CD4＋T，因此 CD8＋T占主导作用。为了研究淋巴细胞亚群动力学，有试验对大肠杆菌性乳房炎初产奶牛乳汁及血液中T淋巴细胞亚群、CD4+/CD8+比率、CD21+T细胞及淋巴细胞增殖情况进行了研究。乳腺内接种104CFU大肠杆菌（A组）和106CFU（B组），与A组相比，在感染后6～24 h的B组更多的淋巴细胞迁移到感染区，而CD8+T是第一个被吸引至感染乳汁中的T细胞。在感染后 6～24 h B组 CD4+/CD8+比率显著下降，CD4+/CD8+大幅下降主要因为乳汁中CD8+T细胞浓度的升高。相反，在感染后72 h，CD4+/CD8+比值增加，两组均增加了约2倍。这一增长主要是由于CD4+T细胞浓度的增加。CD4+T细胞浓度的增加正好与乳汁的CD21+T细胞数量增加相一致。在血液和乳汁中，B组比A组CD8+T细胞的增殖快很多，这也表明大肠杆菌接种剂量的增加能够加速CD8+细胞在炎症区域积聚，而这些细胞是引起大肠杆菌性早期乳房炎乳腺和乳汁中主要的T细胞[13]。乳腺抗原特异性炎症取决于CD4+分泌的IL17A和IFN-γ[14]。炎症NK细胞介导乳腺产生免疫应答过程，主要起杀灭靶细胞、保护乳腺组织的作用。

3.2 体液免疫

奶牛乳腺中B细胞是参与体液免疫应答的重要成分。B细胞对复杂抗原及多种有丝分裂原的识别均需要T细胞协助。患乳房炎时，血液中的B细胞数量降低，而乳房淋巴结中的该细胞数量则升高，可能原因是炎症发展过程中B细胞从血液进入乳腺和乳汁中。

3种主要免疫球蛋白 IgG、IgM和IgA，通过血液选择性进入乳腺内对侵入的致病菌起到重要的杀灭和抑制作用[6]。抗体的滴度高低与奶牛的泌乳阶段和乳房炎症病程发展有关。泌乳初期免疫球蛋白浓度一般较低；接近干乳期和分娩时，乳汁中免疫球蛋白含量逐渐增加，使初乳中免疫球蛋白达到较高水平，可为新生犊牛提供早期被动保护。乳房炎发生时，乳汁中的免疫球蛋白浓度上升。健康乳汁中，IgG1调理作用较弱，不能有效发挥促进中性粒细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬。但乳汁中IgG2的浓度会随炎症的发展而增加。IgM不是乳汁中抵抗病原菌的主力，仅在感染后早期存在[7]。乳汁中IgG2的含量少，但在金黄色葡萄球菌及链球菌感染中起调理作用。正常乳汁中IgA含量低，但能有效阻止病原黏附乳腺上皮细胞，在局部黏膜免疫应答中发挥重要作用。乳头管黏膜和乳头管近端产生的局部IgA抗体和淋巴因子均有抵抗细菌入侵的能力[3]。

4 结语

乳腺不是一个独立的组织器官，受机体遗传、环境及管理因素影响。鉴于奶牛乳腺独特的解剖结构，以及产生具有丰富蛋白乳汁的功能特点，使得乳腺易遭受病原菌的侵入，侵入的病原菌易于受到乳蛋白的保护而不易被机体清除。为了应付各种病原微生物入侵，乳腺首先采用固有免疫机制，如屏障结构和重要抗微生物物质如补体蛋白、溶菌酶、乳铁蛋白和乳过氧化物酶系统等清除病原菌；必要时需要激发机体的适应性免疫如细胞免疫和体液免疫协调作用机制。

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