猪链球菌黏附机制及其相关毒力因子研究进展

付超，刘梦月，赵瑞利，胡烨，马吉飞，崔君

猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）属于球菌科、链球菌属。其自然栖息地是上呼吸道（如咽部、鼻腔等）的黏膜，也可分布于生殖道和消化道等黏膜上，是一种重要的人畜共患病病原体，一般不会引发感染。但若遇到机体免疫力降低时，便能够引起皮肤、呼吸道及软组织感染[1]，可导致猪败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎等，也可导致相关从业人员感染，引起人脑膜炎、败血症、中毒性休克综合征（STSS）等疾病，甚至出现死亡，严重威胁公共卫生和畜产品生产，给养猪业带来了巨大损失[2]。

S.suis在中国的发病率高于欧洲等国家，可感染不同品系、不同年龄、不同性别的动物。按荚膜多糖抗原的不同，S.suis可分成35个血清型（1～34型和1/2型），其中毒力最强的依次为血清2型、1型、9型和7型，其中血清32型和34型是鼠口腔链球菌[3-4]。而在许多欧洲国家，9型是病猪体内主要的血清型。所以，S.suis的血清型致病性是否与地域相关尚未得到证实。

疫苗免疫是防控该病的关键措施，为了获得高滴度抗体，许多研究人员致力于S.suis病原学、致病机制、毒力因子等相关研究，并取得了一定进展。本文通过对S.suis的主要黏附机制和相关毒力因子进行概述，以期为S.suis致病机制及其疫苗开发提供相关参考。

1 主要的宿主黏附机制

迄今为止，许多研究已经提出了很多已证实存在或假设存在的毒力因子及相关因子，这些因子都直接或间接参与S.suis的致病过程。S.suis主要通过伤口、呼吸道途径入侵机体，而呼吸道途径更易于细菌感染。

S.suis通过呼吸道途径入侵机体后定殖于宿主扁桃体，若带菌者健康不发病，则S.suis一直存在。若当机体免疫力下降时，一般认为，菌体会扩散侵入肺组织，进而通过肺循环而侵袭不同的组织器官或引起全身性感染，最终导致菌血症、败血症、脑膜炎、关节炎等临床病理症状[5]。在S.suis定殖宿主过程中，S.suis会通过一些能够识别宿主黏膜细胞表面受体的毒力因子（如溶菌酶释放蛋白、溶血素、纤连蛋白结合蛋白等）而特异性结合宿主的黏膜细胞表面受体（如H因子、纤溶酶原、纤连蛋白等），从而成功定殖于宿主体内。此外，S.suis可以产生某些蛋白酶（精氨酸-氨基肽酶、二肽基肽酶Ⅳ、胰凝乳蛋白酶、酪蛋白酶），这些蛋白酶可能与细菌的黏附侵袭有关[6]。

当由于各种因素导致机体免疫水平下降时，定殖于宿主黏膜细胞表面的S.suis便会与上皮细胞黏膜发生相互作用，此时由于宿主黏膜上皮杯状细胞分泌的黏液层（包含有脂类、免疫球蛋白类和糖蛋白类）可以产生一定的抵抗作用，故菌体通过一些毒力因子及酶的作用破坏宿主黏膜屏障，从而入侵机体。即是S.suis可以通过相关类枯草杆菌蛋白酶A与宿主的黏液层相连，从而黏附宿主黏膜上皮细胞。随后，其可能会通过溶血素或者一些蛋白酶的作用，而降解宿主细胞的炎性介质、破坏细胞的紧密连接或者通过跨细胞途径而侵入细胞外基质，引起机体的炎症反应。此外，S.suis也可以通过蛋白酶（包括一些表面蛋白质、毒素和酶）或毒力因子（如纤连蛋白结合蛋白等）与细胞外基质组分（ECM）结合，从而增加菌体在宿主体内的扩散范围，并通过一些酶（如腺苷合酶等）抵抗宿主免疫细胞的攻击。同时，通过补体降解、补体沉积抑制、补体灭活等途径抵抗补体对其所介导的细胞溶解作用。通过上述途径，S.suis可进入机体后随血流从而引起宿主发生相应的疾病[7]。

此外，S.suis的许多毒力因子（如溶菌酶释放蛋白、溶血素、纤连蛋白结合蛋白等）都表现出一定的细菌黏附能力，因此细菌对于宿主细胞的黏附可能是多种黏附素参与作用的结果，其他相关粘附因子有待于进一步证实。

2 经典的毒力因子

S.suis的致病力强弱与毒力因子密切相关，因此研究其毒力因子极具实际价值。在致病过程中，这些毒力因子与宿主黏膜相互作用，从而影响细菌的黏附力及致病性，但在致病过程中各毒力因子之间是否存在相互作用有待进一步研究。

2.1 荚膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）

由N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖及唾液酸构成，CPS作为S.suis的分型标志之一，也是S.suis抵抗巨噬细胞吞噬的重要蛋白[8]。其能够促进机体产生相应的抗体，主要通过影响菌体与上皮细胞及吞噬细胞之间的黏附性来发挥作用。同时，有实验表明，CPS缺失株表现无毒，极易被吞噬细胞所吞噬。此外，一般认为，S.suis的抗吞噬能力与CPS厚度呈正相关关系[9]。临床上，通常采用经纯化的添加弗氏不完全佐剂对猪进行免疫，能产生抗体，但不能抵抗全菌感染[10]。

2.2 溶菌酶释放蛋白（Muramidase-releasedprotein，MRP）和胞外因子（Extracellular factor，EF）

MRP和EF是S.suis2毒力强弱的标志[11]。MRP是细菌的胞壁大分子糖蛋白，分子量为136 kDa，亦是S.suis2的一种黏附素。其黏附作用可被半乳糖所阻断，但除半乳糖外，MRP是否有其他的识别基团，仍有待证实[12]。EF主要由血清1、2、1/2、14、15型菌株产生，分子量为110 kDa，仅能在培养细菌的上清液中分离得到[8]。与病猪相比，健康母猪的血清型2中MRP+/EF+/Sly+的出现频率显著降低，表明MRP和EF在致病过程中起着重要作用。在用不同的表现型菌株感染小猪时发现，MRP+EF+的表现型菌株可引起典型的脑炎、多发性浆液炎及多发性关节炎[13]。采用亲和层析法提取S.suisMRP和EF，后与WO（油包水乳液佐剂）制备亚单位疫苗，可产生高滴度抗体，能有效保护机体免受S.suis2毒株侵袭[14]。此外，MRP的N末端与人源纤维蛋白原（hFg）中D片段的Aα和Bβ链结合，通过一种αXβ2整合素依赖机制，hFg-MRP的这种相互作用能够导致多形核中性粒细胞（PMNs）的聚集和衰亡，同时能够促进病原菌在宿主血液中的存活[15]。

2.3 溶血素（Suilysin，Sly）

Sly也称S.suis溶血素，是S.suis强毒株的标志之一，分子量约为54～62 kD，分泌于上清中，属于巯基活化类毒素，具有较强细胞毒性，其对微血管内皮细胞具有很强的破坏作用[16]。可被氧化剂、胆固醇及蛋白酶K完全抑制，其产量受培养条件影响极大。S.suis2对动物致病性的差异可能与Sly对不同动物的红细胞的敏感性差异有关[17]。Sly导致S.suis不同的溶血活性，有助于细菌的增殖、脑部炎症的增强和死亡率的增加[18]。

2.4 纤连蛋白原结合蛋白（Fibrinogen-binding proteins，FnBPs）

FnBPs是一种无锚定黏附蛋白，广泛存在于各血清型S.suis中，纯化FnBPs蛋白显示主要可以结合人纤连蛋白和纤维蛋白原，而敲除基因后，突变株毒力有所下降，但在血中的增殖能力并未受到影响，表明其具有干扰纤连蛋白正常功能和提供黏附能力的作用。有研究表明FnBPs的N端及C端的晶体结构及全长蛋白的结构。FnBPs由具有独特折叠的两个域组成，其中FnBPs的C-末端结合宿主纤连蛋白，N-末端附着于细菌表面，促进S.suis对宿主细胞的黏附[19-20]。同时，FnBPs通过β1整合素受体激活信号传导通路，诱导产生趋化因子，进而导致嗜中性粒细胞浸润增加，促进细菌在中枢神经系统（CNS）中的扩散。

3 相关蛋白及酶类

除了几种经典的毒力因子外，其他S.suis生长代谢相关蛋白及酶类也与细菌黏附及毒力有密切关系。这些蛋白及酶类均具有较好的免疫原性，在S.suis的黏附致病过程中发挥着重要的作用。

3.1 相关蛋白

主要包括金属结合脂蛋白A、Cbp40、Trag、CcpA、SrtA（SortaseA蛋白）、Sao蛋白、SsMps蛋白、IgG结合蛋白等[21-22]。其中SsMps蛋白作为菌毛骨架，存在于S.suis2的胞壁上，呈不同聚体状态，直接接触宿主细胞或蛋白，可以结合宿主一种重要免疫因子，影响细菌黏附，对致病性起着重要的作用。其天然状态下可能会共价连接小分子量寡糖或肽，但这有待进一步证实[23]。

3.2 相关酶类

主要包括谷氨酸脱氢酶（GDh）、肽聚糖水解酶、谷氨酰胺合成酶、精氨酸脱亚氨酸酶系统（ADS）、次黄嘌呤单磷酸脱氢酶（IMPDH）、烯醇酶（enolase）、甲酸四氢叶酸连接酶（Fhs）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、Ⅳ型二肽基肽酶（DPPⅣ）、谷氨酰胺合成酶（GlnA）、IgA蛋白酶、IgM蛋白酶等[21-22]。

有研究显示[24]，使用鼠和仔猪感染模型，Fhs对于S.suis2的完全毒力是必需的，敲除Fhs基因在体外对S.suis2生长没有影响。

4 其他因子

使用无毒力株和毒力株通过生物信息学和构建基因敲除株等方法鉴定出多种新型毒力因子，主要包括浑浊因子（OFS）、pgdA基因、分泌性核酸酶A（ssnA）基因、dltA基因、转录调控因子（plcR）、致病性相关阅读框（orf2）、毒力调控子（covR）、感染相关因子Trag、反应调控因子（RevS）等[25-26]。这些毒力因子大多数都具有较好的免疫原性，在S.suis的致病过程中发挥十分重要的作用。

此外，有研究表明，S.suis致病过程中，毒力因子的表达处于动态变化中，随着转录调控因子的调控发生而发生着变化，这表明S.suis可能通过一些调控基因来调控毒力因子的表达与致病[22]。在芽孢杆菌属细菌中，plcR作为多效调节子，可以调控卵磷酶和单个或多个蛋白酶基因的表达，对其致病力有着一定调控作用[27]。但在S.suis2中的作用却未见报道，陈恬[28]通过构建plcR基因缺失突变株，并用其野生株和突变株分别感染BALB/c小鼠，结果显示plcR基因缺失突变株的毒力较野生株显著降低，表明plcR作为特有的外源基因，其与S.suis2致病性相关联。

5 结语

S.suis不仅可以引起猪群发病，而且可以突破种群障碍感染人，甚至引起死亡，给养猪业的经济和相关从业人员的健康带来了巨大威胁，故需对其进行有效防控。S.suis对于宿主的黏附作为其感染致病的首要步骤，研究该机制是防治S.suis的关键所在，许多毒力因子也都直接或间接参与S.suis的致病过程，并对其致病力产生了一定影响。此外，有文献显示[29]，鸟类也可充当该病的传播媒介。

此外，由于近年来S.suis的耐药情况复杂，滥用抗生素较为严重，耐药情况呈逐年加重的趋势[30]，故该病的防治工作更加艰巨。随着科学技术的迅速发展，研究S.suis菌株（尤其S.suis2强毒株）的黏附机制以及相关毒力因子（包括潜在毒力因子）均具有重要的实际意义，猪源S.suis的病原学、致病性等研究得越来越深入，将为猪链球菌病的防控及动物性食品安全提供保障。

[1]Segura M.Streptococcus suis：an emerging human threat[J].The Journal of Infectious Diseases，2008，199（1）：4-6.

[2]Sánchez D R V，Fernández-Garayzábal J F，Domínguez L，et al.Screening of virulence-associated genes as a molecular typing method for characterization ofStreptococcus suis isolates recovered from wild boars and pigs[J].Veterinary Journal，2015，209（3）：108-112.

[3]Lun Z R，Wang Q P，Chen X G，et al.Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen[J].The Lancet Infectious Diseases，2007，7（3）：201-206.

[4]黎敏.2型猪链球菌分离鉴定及毒力基因检测[J].广东畜牧兽医科技，2016，41（3）：18-20.

[5]周康，李宗明，李江华，等.猪链球菌Ⅱ型五种感染途径感染猪模型的比较[J].中国动物传染病学报，2016，24（2）：35-41.

[6]Marie-Claude J，Daniel G.Identification and characterization of four proteases produced byStreptococcus suis[J].FEMS Microbiology Letters，2003，220（1）：113-119.

[7]Segura M，Calzas C，Grenier D，et al.Initial steps of the pathogenesis of the infection caused byStreptococcus suis：fighting against nonspecific defenses[J].FEBS Letters，2016，590（21）：3772-3799.

[8]刘耀川，宋淑英，张泽辉，等.猪链球菌毒力因子简介[J].湖北畜牧兽医，2015，36（3）：7-8.

[9]曾巧英，陆承平.猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡[J].微生物学报，2003（3）：407-412.

[10]陈瑶，张雅为，王宏燕，等.猪链球菌2型研究进展[J].现代畜牧兽医，2010（7）：72-74.

[11]黎敏.2型猪链球菌分离鉴定及毒力基因检测[J].广东畜牧兽医科技，2016，41（3）：18-20.

[12]曾巧英，陆承平.猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用[J].南京农业大学学报，2002，25（4）：67-71.

[13]Vecht U，Wisselink H J，Jellema M L，et al.Identification of two proteins associated with virulence ofStreptococcus suistype 2[J].Infection and Immunity，1991，59（9）：3156-3162.

[14]Wisselink H J，Vecht U，Stockhofe-Zurwieden N，et al.Protection of pigs against challenge with virulentStreptococcus suisserotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine[J].Veterinary Record，2001，148（15）：473-477.

[15]Pian Y Y，Li X Q，Zheng Y L，et al.Binding of Human Fibrinogen to MRP EnhancesStreptococcus suisSurvival in Host Blood in a αXβ2Integrin-dependent Manner[J].Scientific Reports of Nature，2016，6（26966）：1-12.

[16]吴萍萍.猪链球菌2型毒力因子及疫苗候选蛋白研究进展[J].畜牧与饲料科学，2013（11）：123-127.

[17]高尚庆，雷连成，韩文瑜.猪链球菌2型主要毒力因子研究进展[J].中国生物制品学杂志，2006，19（6）：657-659.

[18]Chen S L，Xie W L，Wu K，et al.Suilysin Stimulates the Release of Heparin Binding Protein from Neutrophils and Increases Vascular Permeability in Mice[J].Front in Microbiology，2016，7（1338）：1-12.

[19]Musyoki A M，Shi Z Y，Xuan C L，et al.Structural and functional analysis of an anchorless fibronectin-binding protein FBPS from Gram-positive bacteriumStreptococcus suis[J].PNAS of USA，2016，113（48）：13869-13874.

[20]Hoffmann C，Ohlsen K，Hauck C R.Integrin-mediated uptakeoffibronectin-bindingbacteria[J].European Journal of Cell Biology，2011，90（11）：891-896.

[21]吴立志，王金良，肖跃强，等.猪链球菌2型毒力因子研究进展[J].动物医学进展，2012，33（6）：118-122.

[22]Fittipaldi N，Segura M，Grenier D，et al.Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swinepathogenandzoonoticagentStreptococcus suis[J].Future Microbiology，2012，7（2）：259-279.

[23]杨宝玲，陈福广，谢芳，等.2型猪链球菌SsU05-0474的表达纯化及单克隆抗体制备[J].中国动物传染病学报，2016，24（2）：25-30.

[24]Zheng C K，Xu J L，Shi G L，et al.Formatetetrahydrofolate ligase is involved in the virulence of Streptococcus suisserotype2[J].Microbial Pathogenesis，2016，98（9）：149-154.

[25]鞠爱萍，王长军，李明，等.猪链球菌2型反应调控因子RevS突变株的构建[J].中华流行病学杂志，2008，29（1）：59-64.

[26]Greeff A d，Buys H，Alphen L V，et al.Response regulator important in pathogenesis ofStreptococcus suisserotype 2[J].Microbial Pathogenesis，2002，33（4）：185-192.

[27]王玲，陈亚华，Mahillon J，等.蜡状芽胞杆菌转录激活子pIcR调控多基因的表达[J].微生物学报，2001，41（3）：304-309.

[28]陈恬.SezAT系统及PlcR转录调控因子在2型猪链球菌中的作用研究[D].重庆：第三军医大学，2014.

[29]浦坚华，毛紫微，王琼，等.猪链球菌病的研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2016（4）：13-15.

[30]张维谊，王晓旭，宁昆，等.猪源猪链球菌耐药情况分析[J].中国农业信息，2016（11）：101-103.