新型吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂的设计、合成及生物活性

刘志雄, 王小龙, 薛 鑫, 李福卫, 于海涛

(南京中医药大学 药物合成技术研究中心，江苏 南京 210023)

·研究论文·

新型吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂的设计、合成及生物活性

刘志雄, 王小龙, 薛 鑫, 李福卫, 于海涛*

(南京中医药大学 药物合成技术研究中心，江苏 南京 210023)

分别以5-溴-2-氟苯甲腈(1a)和3-溴苯甲腈(1b)为原料，经Sonogashira偶联，脱三甲基硅基保护基，三分子偶联及水解等5步反应制得中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6a)和3-[(4-氧代-3,4-二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6b)。环烷基甲酸经酰氯化，缩合和脱Boc保护基3步反应制得环烷基哌嗪-1-基甲酮(7a～7c)。 6a与NCS(1 eq.)反应制得5-[(6-氯-4氧代-3,4二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6c); 6a与NCS(2 eq.)反应制得5-[(6,7-二氯-4氧代-3,4二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6d)。 6a～6d, 6a～6c分别与7a～7c和1-(2-嘧啶基)哌嗪在TBTU(缩合剂)，DIPEA(碱)的作用下合成了13个新型吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂(8a～8m)，其结构经1H NMR和MS(ESI)表征。采用Alarm blue法研究了8a～8m对肿瘤细胞MDA-MB-436的抑制活性(IC50)。结果表明：8f, 8g, 8i和8j对MDA-MB-436有较强的抑制活性(IC50=30.5～69.3 nmol·L-1)。

苯甲腈; 吡咯并三嗪酮; PARP-1抑制剂; 合成; 生物活性

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一种家族酶，它们催化ADP核糖单元从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(DAD+)转移至各种蛋白底物上。该家族酶包括17个成员，其中PARP-1研究最为广泛。PARP-1的主要功能为作为DNA修复因子，其效果在碱基切除修复过程中尤为显著[1-6]。

Chart 1

2014年12月，FDA批准了全球首种PARP-1抑制剂——奥拉帕尼(Olaparib)，用于治疗BRCA基因突变的卵巢癌患者。研究表明，PARP-1的C端催化区的天然底物为NAD+，根据催化区域位置和功能的不同，可以分为3个结合位点[7]：烟酰胺-核糖结合位点(NI site)、磷酸结合位点(PH site)和腺苷-核糖结合位点(AD site)。现有的PARP-1抑制剂大多通过与NAD+竞争性结合PARP-1的NI site而产生活性[8]。NAD+与NI site的结合模式为：(1)吡啶环与PARP-1蛋白的Tyr896和Tyr907产生π-π堆积作用。(2)甲酰胺基团与PARP-1蛋白的Gly863和Ser904形成3个氢键(Chart 1)[9]。

本文通过分析Olaparib的分子结构特点和NAD+与PARP-1的作用机制，设计并合成了未见文献报导的新型吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂(8a～8m)并研究了其生物活性。(1)将苯环改变成吡咯环，增加芳香环的富电性，考察对这种π-π堆积作用力的影响。减小A环的空间体积，使抑制剂继续深入PARP-1的V字形口袋，考察该改变对抑制剂与PARP-1蛋白的氢键结合力的影响。(2)保留哌嗪环为碱性末端以调节水溶性，并以PARP-1抑制剂结构中常见的环丙基羰基、2-嘧啶基及环戊基羰基连接哌嗪环(Chart 2)。

Chart 2

以5-溴-2-氟苯甲腈(1a)和3-溴苯甲腈(1b)为原料，经Sonogashira偶联，脱三甲基硅基保护基，三分子偶联及水解等5步反应制得中间体2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6a)和3-[(4-氧代-3,4-二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]苯甲酸(6b)。环烷基甲酸经酰氯化，缩合和脱Boc保护基3步反应制得环烷基哌嗪-1-基甲酮(7a～7c)。 6a与NCS(1 eq.)反应制得5-[(6-氯-4氧代-3,4二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6c); 6a与NCS(2 eq.)反应制得5-[(6,7-二氯-4氧代-3,4二氢吡咯[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基)甲基]-2氟-苯甲酸(6d)。 6a～6d, 6a～6c分别与7a～7c和1-(2-嘧啶基)哌嗪在TBTU(缩合剂)，DIPEA(碱)的作用下合成了13个新型吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂(8a～8m)，其结构经1H NMR和MS(ESI)表征。采用Alarm blue法研究了8a～8m对肿瘤细胞MDA-MB-436的抑制活性(IC50)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

X-5型显微熔点仪；Bruker Ascend 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Agilent 1100型液质联用仪；Bio-Tek Synergy HT型多标记微孔板检测仪;Invitrogen C10281 Countess型自动细胞计数器。

人乳腺癌细胞(MDA-MB-436)，美国模式菌种收集中心；Alarm Blue试剂，Sigma公司；其余所用试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 合成

(1) 2a和2b的合成(以2a为例)

在反应瓶中依次加入1a 12.0 g(60.00 mmol),碘化亚铜0.576 g(3.0 mmol), PdCl2(PPh3)22.1 g(2.9 mmol),三乙胺25.2 mL(181.5 mmol)，三甲基硅乙炔8.52 mL(60.28 mmol)和THF 200 mL,氮气保护，搅拌下回流(60 ℃)反应18 h(TLC监测)。冷却至室温，加入饱和氯化铵水溶液400 mL,分液，水相用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液(300 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(EA) ∶V(PE)=1 ∶20]纯化得棕色油状液体2-氟-5-三甲基硅烷乙炔基苯甲腈(2a)9.96 g,产率76.6%。

用类似的方法合成棕色油状液体3-(三甲基硅基乙炔基)苯甲腈2b，收率80%[10]。

(2) 3a与3b的合成(以3a为例)

在反应瓶中依次加入四正丁基氟化铵35.9 g(137.30 mmol)和THF 200 mL，于室温缓慢滴加至2a 9.96 g(45.83 mmol)的THF(400 mL)溶液中，反应完全(TLC监测)。加入饱和氯化铵水溶液400 mL，分液，水相用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液(300 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干，残余物经硅胶柱层析[A=V(EA) ∶V(PE)=3 ∶1]纯化得黄色固体5-乙炔基-2-氟苯甲腈(3a)5.86 g，产率88.1%。

用类似的方法合成黄色固体3b,产率83.0%[10]。

(3) 4a和4b的合成(以4a为例)

在反应瓶中依次加入对甲苯磺酰叠氮6.0 g(30.42 mmol)，氯化亚铜0.3 g(3.04 mmol), 4a 5.3 g(36.51 mmol)和氯仿60 mL，氮气保护，于室温搅拌10 min；依次加入三乙胺5.10 mL(36.51 mmol)和吡咯6.30 mL(91.27 mmol),于45 ℃反应4 h(TLC监测)。加入饱和氯化铵水溶液100 mL，分液，水相用二氯甲烷(3×50 mL)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液(300 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干得灰色固体N-[2-(3-氰基-4-氟苯基)-1-(1H-吡咯-2-基)亚乙基]-4-甲基苯磺酰胺(4a)7.95 g，产率68.5%; MS(ESI)m/z: 382.1{[M+H]+}。

用类似的方法合成灰色固体4b,产率70.0%; MS(ESI)m/z:364.1{[M+H]+}[11]。

(4) 5a和5b的合成(以5a为例)

在反应瓶中依次加入4a 7.0 g(18.35 mmol)，肼基甲酸乙酯2.8 g(26.89 mmol)和叔丁醇50 mL，氮气保护，于室温搅拌10 min;加入叔丁醇钾6.0 g(53.47 mmol),回流(80 ℃)反应12 h(TLC监测)。冷却至室温，加入水100 mL，用1 mol·L-1盐酸溶液调至pH≈7，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，合并有机相，用饱和NaCl溶液(300 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=1 ∶10)纯化得黄色粉末2-氟-5-(4-氧代-3,4-二氢吡咯并[1,2-d][1,2,4]三嗪-1-基-甲基)苯甲腈(5a)4.21 g，产率86.3%;1H NMRδ: 12.18(s, 1H), 7.93(dd,J=6.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.81～7.70(m, 2H), 7.46(t,J=9.1 Hz, 1H), 6.93(dd,J=3.7 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.83～6.76(m, 1H), 4.15(s, 2H); MS(ESI)m/z: 269.0{[M+H]+}。

用类似的方法合成黄色粉末5b,产率79.6%;1H NMRδ: 12.19(s, 1H), 7.86(s, 1H), 7.72(dd,J=17.0 Hz, 4.7 Hz, 1H), 7.52(t,J=7.8 Hz, 1H), 6.93(d,J=3.4 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.3 Hz, 1H), 4.17(s, 2H); MS(ESI)m/z: 251.1{[M+H]+}。

(6) 6a与6b的合成(以6a为例)

在反应瓶中依次加入5a 1.8 g(6.71 mmol)，氢氧化钠1.4 g(35.00 mmol)和水30 mL，于室温搅拌10 min，回流(90 ℃)反应8 h(TLC监测)。冷却至室温。滴加1 mol·L-1盐酸溶液调至pH酸性，析出白色固体，过滤，滤饼用混合溶液(A=1 ∶5)洗涤，真空干燥得白色固体6a 1.8 g,产率93.3%;1H NMRδ: 13.20(s, 1H), 11.84(s, 1H), 7.79(dd,J=7.1 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.62～7.48(m, 1H), 7.37～6.99(m, 3H), 6.31～6.13(m, 1H), 4.14 (s, 2H); MS(ESI)m/z: 288.0{[M+H]+}。

用类似的方法合成白色固体6b;1H NMRδ: 13.10(s, 1H), 11.74(s, 1H), 7.75(s, 1H), 7.54～7.24(m, 4H), 6.91(s, 1H), 6.80(s, 1H), 4.14(s, 1H); MS(ESI)m/z: 270.0{[M+H]+}。

(7) 6c和6d的合成(以6c为例)

将NCS 0.496 g(3.71 mmol, 1 eq.)溶于二氯甲烷30 mL中，氮气保护下，于-5 ℃依次加入四氯化锆86.6 mg(0.371 mmol)和6a 1.0 g(3.71 mmol)，加毕，缓慢升至室温，反应完全(TCL监测)。加水50 mL，析出固体，过滤，滤饼用混合溶液(A=1 ∶5)洗涤，真空干燥得淡黄色固体6c 0.89 g，产率80.0%;1H NMRδ: 12.04(s, 1H), 7.69(dd,J=7.0 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.44～7.36(m, 1H), 7.06(dd,J=10.4 Hz, 8.5 Hz, 1H), 6.83(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.72(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.00(s, 2H); MS(ESI)m/z: 322.0{[M+H]+}。

仅改变NCS为2 eq.，用类似的方法合成黄色固体6d, 产率86%;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.75(dd,J=7.1 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.55～7.48(m, 1H), 7.24(dd,J=10.7 Hz, 8.6 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.25(s, 2H); MS(ESI)m/z: 356.0{[M+H]+}[12]。

(8) 7a～7c的合成(以7c为例)

将环戊酸1.0 g(8.76 mmol)溶于氯化亚砜(10 mL)中，回流2 h。旋干氯化亚砜，残余物用二氯甲烷10 mL溶解；缓慢滴加N-Boc哌嗪1.7 g(9.13 mmol)的二氯甲烷(10 mL)溶液，滴毕，搅拌下于室温反应2 h。旋干二氯甲烷，残余物真空干燥得白色固体4-环戊基基甲酰基哌嗪-1-甲酸叔丁酯2.3 g，产率93%。

将4-环戊基-甲酰基哌嗪-1-甲酸叔丁酯2.3 g(8.14 mmol)溶于无水甲醇(20 mL)中，剧烈搅拌下通入干燥HCl气体(1 h);析出大量白色固体，停止通气，于室温反应1 h。旋干反应液，残余物加入碳酸钠溶液20 mL，用二氯甲烷(3×30 mL)萃取，合并有机相，依次用大量饱和碳酸钠溶液和氯化钠饱和溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干，残余物真空干燥得无色油状液体环戊基-哌嗪-1-基甲酮(7c)1.41 g，产率95%;1H NMRδ: 3.57(t,J=4.0 Hz, 2H), 3.47(t,J=4.0 Hz, 2H), 2.84～2.87(m, 5H), 2.21(s, 1H), 1.65～1.77(m, 6H), 1.48～1.58(m, 2H); MS(ESI)m/z: 183.1{[M+H]+}。

用类似的方法合成无色油状液体环丁基-哌嗪-1-基甲酮(7b), 产率91%;1H NMRδ: 3.48～3.16(m, 6H), 2.70～2.55(m, 5H), 2.22～1.63(m, 5H); MS(ESI)m/z: 169.1{[M+H]+}。

无色油状液体环丙基-哌嗪-1-基甲酮(7a)，产率92%;1H NMRδ: 3.65(t,J=4.0 Hz, 2H), 3.44(t,J=6.0 Hz, 2H), 3.32(m, 3H), 3.29(m, 2H), 1.97(s, 1H), 0.73(dt,J=9.5 Hz, 5.3 Hz, 4H); MS(ESI)m/z: 155.1{[M+H]+}。

(9) 8a～8m的合成(以8b为例)

在反应瓶中依次加入6b 2.0 g(7.43 mmol), 7c 1.4 g(7.68 mmol)，苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)3.6 g(11.21 mmol),N,N-二异丙基乙胺2.9 g(22.44 mmol)和DMF 20 mL，搅拌下于室温反应3 h。加入水100 mL，用1 mol·L-1盐酸调至pH=7，析出大量固体，继续滴加盐酸至无固体析出。过滤，滤饼依次用大量水和少量乙醇洗涤，真空干燥得白色固体1-[3-(4-环戊基羰基-1-哌嗪-1-甲酰基)苄基]-3H-吡咯并[1,2-d][1,2,4]三嗪-4-酮(8b)3.0 g，产率93.0%[13]。

用类似的方法合成白色固体8a, 8c～8m。

8a: 产率91.0%, m.p.131.2～134.3 ℃;1H NMRδ: 7.29(d,J=7.3 Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 6.80(s, 1H), 4.14(s, 2H), 3.90～3.00(m, 8H), 0.84(m, 1H), 0.75～0.72(m, 4H); MS(ESI)m/z: 406.1{[M+H]+}。

8b: 产率92.1%, m.p.142.2～145.4 ℃;1H NMRδ: 12.21(s, 1H), 7.75(d,J=7.6 Hz,1H), 7.45～7.37(m, 3H), 7.27(d,J=7.4 Hz,1H), 6.91(d,J=2.6 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.2 Hz, 1H), 4.13(s, 2H), 3.54～3.27(m, 8H), 1.65～1.53(m, 8H), 0.88～0.82(m, 1H); MS(ESI)m/z: 434.2{[M+H]+}。

8c: 产率92.1%, m.p.126.1～131.0 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.74(d,J=1.5 Hz, 1H), 7.42～7.58(m, 2H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=2.8 Hz, 1H), 6.80(d,J=2.9 Hz, 1H), 4.13(s, 2H), 3.19～3.76(m, 8H), 1.99～2.04(m, 1H), 0.72～0.75(m, 4H); MS(ESI)m/z: 424.1{[M+H]+}。

8d: 产率93.2%, m.p.139.1～142.2 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.75(d,J=1.6 Hz, 1H), 7.43(dd,J=32.8 Hz, 13.2 Hz, 2H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=2.6 Hz, 1H), 6.8(s, 1H), 4.11(s, 2H), 3.54～3.27(m, 8H), 1.65～1.53(m, 8H), 0.88～0.82(m, 1H); MS(ESI)m/z: 452.2{[M+H]+}。

8e: 产率92.1%, m.p.109.5～114.8 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.46(ddd,J=12.5 Hz, 7.6 Hz, 5.2 Hz, 1H), 7.41(d,J=5.4 Hz, 1H), 7.25(s, 1H), 6.90(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.80(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.06(s, 2H), 3.82～3.09(m, 8H), 1.33～0.61(m,5H); MS(ESI)m/z: 458.1{[M+H]+}。

8f: 产率93.2%, m.p.115.1～117.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.46(dd,J=7.1 Hz, 4.5 Hz, 1H), 7.39(d,J=6.3 Hz, 1H), 7.24(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.89(t,J=3.9 Hz, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.05(s, 2H), 3.63～3.10(m, 8H), 2.23～1.58(m, 7H); MS(ESI)m/z: 472.1{[M+H]+}。

8g: 产率93.6%, m.p.116.6～119.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 7.47(s, 1H), 7.40(d,J=5.8 Hz, 1H), 7.24(t,J=8.9 Hz, 1H), 6.89(s, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 4.05(s, 2H), 3.55～3.18(m, 8H), 1.84～1.24(m, 9H); MS(ESI)m/z: 486.1{[M+H]+}。

8h: 产率92.1%, m.p.119.2～121.4 ℃;1H NMRδ: 12.20(s, 1H), 7.39(d,J=5.9 Hz, 1H), 7.33～7.29(m, 1H), 7.24(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.98(s, 1H), 4.23(s, 2H), 3.84～3.12(m, 8H), 0.95～0.61 (m, 5H); MS(ESI)m/z: 492.1{[M+H]+}。

8i: 产率94.2%, m.p.123.1～125.3 ℃;1H NMRδ: 12.22(s, 1H), 7.37(s, 1H), 7.29(d,J=6.4 Hz, 1H), 7.23(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.22(s, 2H), 3.65～3.06(m, 8H), 2.22～1.61(m, 7H); MS(ESI)m/z: 506.1{[M+H]+}。

8j: 产率91.3%, m.p.126.1～129.3 ℃;1H NMRδ: 12.23(s, 1H), 7.38(s, 1H), 7.30(dd,J= 6.4 Hz, 2.0 Hz, 1H), 7.24(t,J=8.0 Hz, 1H), 6.99(s, 1H), 4.23(s, 2H), 3.68～2.84(m, 8H), 1.82～1.12(m, 9H); MS(ESI)m/z: 520.1{[M+H]+}。

8k: 产率91.4%, m.p.198.5～220.3 ℃;1H NMRδ: 12.21(s, 1H), 8.39(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.75(dd,J=2.8 Hz, 1.2 Hz, 1H), 7.48～7.38(m, 3H), 7.30(d,J=7.5 Hz, 1H), 6.92(dd,J=3.7 Hz, 1.2 Hz, 1H), 6.80(t,J=3.0 Hz, 1H), 6.68(t,J=4.7 Hz, 1H), 4.14(s, 2H), 3.82～3.27(m, 8H); MS(ESI)m/z: 416.2{[M+H]+}。

8l: 产率93.1%, m.p.220.2～223.1 ℃;1H NMRδ: 9.44(s, 1H), 8.35(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.77(d,J=1.6 Hz, 1H), 7.40～7.28(m, 2H), 7.08(t,J=8.7 Hz, 1H), 6.73(t,J=3.3 Hz,1H), 6.57(t,J=4.7 Hz, 1H), 6.66(d,J=2.7 Hz, 1H), 4.08(s, 2H), 3.84～3.40(m, 8H); MS(ESI)m/z: 434.2{[M+H]+}。

8m: 产率94.1%, m.p.225～228.4 ℃;1H NMRδ: 12.06(s, 1H), 8.39(d,J=4.7 Hz, 2H), 7.50～7.45(m, 1H), 7.42(dd,J=6.5 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.25(t,J=9.0 Hz, 1H), 6.91(d,J=4.1 Hz, 1H), 6.79(d,J=4.0 Hz, 1H), 6.68(t,J=4.7 Hz, 1H), 4.06(s, 2H), 3.87～3.79(m, 2H), 3.75～3.65(m, 4H), 3.31～3.24 (m, 2H); MS(ESI)m/z: 468.1{[M+H]+}。

1.3 抗肿瘤活性测试

(1) 细胞培养

MDA-MB-436解冻后，置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的MEM培养基中，放入二氧化碳培养箱，在37 ℃, 5%CO2条件下培养。铺板前，应使细胞传两代以上。

(2) 受试化合物配制

以DMSO为空白溶媒，AZD2281为阳性对照。分别称取适量AZD2281和受试化合物，加入适量DMSO，涡旋振荡使其完全溶解，分装后放入冰箱(-80 ℃)保存。

(3) IC50的测定

检查每板细胞密度，保证细胞处于对数生长期。用0.25%胰蛋白酶消化细胞后制成单细胞悬液，计数。细胞悬液离心5 min(2 000～3 000 r·min-1)，取上清液，用少量新配培养液润洗，沉淀，合并上清液，稀释，调整细胞浓度为1×104个/mL。使用12-通道移液枪将细胞悬液按100 mL/孔加入到96孔细胞培养板中，余下每孔各加PBS 200 μL。将96孔板置于孵箱内培养过夜。每孔加入含系列浓度受试化合物的完全培养液或对照的完全培养液100 μL。将板置于孵箱内培养72 h。去除每孔中的培养液，每孔加入含有相应药物的新鲜培养液200 μL，继续培养72 h。将1 mmol·L-1Alarm blue溶液22 μL加至96孔板各孔中后，培养7 h。振荡10 s，测试波长530 nm和590 nm处各孔的荧光强度，计算IC50[14-17]。

2 结果与讨论

2.1 合成

合成5c和5d的关键是控制5a与NCS的当量比，反应温度和反应时间。当5a与NCS的当量比为1 ∶1，反应温度控制在0 ℃以下，反应时间控制在0.5 h内时，大部分产物为一氯代物5c，极少量产物为二氯代物5d，产率约80%。当5a与NCS的当量比为1 ∶2，反应温度控制在0 ℃以下，反应时间控制在0.5 h内时，大部分产物为二氯代物5d，少部分产物为一氯代物和三氯代物，产率约86%。

2.2 生物活性和初步构效关系

表1为目标化合物对MDA-MB-436肿瘤细胞的抑制活性。

表1 8a～8m对MDA-MB-436的抑制活性Table 1 Inhibition activities of 8a～8m against MDA-MB-436

从表1可以看出，8f, 8g, 8i, 8j的抑制活性较好(IC50<100 nmol·L-1)，但均比对照药Olaparib差。这说明增加芳香环的富电性不能增强π-π堆积作用力。8a与8c, 8b与8d活性相当，说明结构中引入F不能显著增强抑制剂活性，这可能是因为H和F体积接近所致。8e和8h的抑制活性明显优于8c, 8j和8g明显优于8d, 8m优于8l，说明增大A环的体积可以提高化合物活性，其可能原因为：环体积增大使抑制剂与PARP-1蛋白结合更紧密，增大了相互之间的氢键作用力。8f与8g活性明显优于8e, 8i与8j活性明显优于8h，说明末端取代优先选择体积较大的基团，这可能是因为大基团有助于增强抑制剂与PARP-1蛋白之间的氢键作用力。

以5-溴-2-氟苯甲腈(3-溴苯甲腈)为原料,合成了13个新型的吡咯并三嗪酮类PARP-1抑制剂(8a～8m)。采用Alarm blue法研究了8a～8m对MDA-MB-436肿瘤细胞的抑制活性。结果表明：8f, 8g, 8i和8j的抑制活性较好(IC50<100 nmol·L-1)。初步构效关系表明：(1)增加芳香环富电性不能增加抑制活性；(2)结构中引入氟原子不能显著增加化合物活性；(3)吡咯环上有一氯取代和二氯取代的化合物活性明显优于无取代物；(4)末端取代时，环丁基与环戊基取代化合物活性明显优于环丙基。

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Design, Synthesis and Biological Activities of Novel PARP-1 Inhibitors with Pyrazolotriazinone Skeleton

LIU Zhi-xiong, WANG Xiao-long, XUE Xin, LI Fu-wei, YU Hai-tao*

(Research Center of Pharmaceutical Synthesis Technology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

The intermediates, 2-fluoro-5-[(4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4]triazin-1-yl)methyl]benzoic acid(6a) and 3-[(4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4]triazin-1-yl)methyl]benzoic acid(6b) were obtained by a five-step reaction of Sonogashira coupling, deprotection, triplet coupling, hydrolysis, etc, using 5-bromo-2-fluorobenzonitrile(1a) and 3-bromobenzonitrile(1b) as the materials, respectively. Cycloalkylpiperazin-1-ylmethanone(7a～7c) were prepared by a three-step reaction of chlorination, condensation and deprotection from cycloalkylcarboxylic acid. 5-(6-Chloro-4-oxo-3,4-dihydropyrrolo[1,2-d][1,2,4] triazin-1-yl)-2-fluoro-benzoic acid(6c) and 5-[(6,7-dichloro-4-oxo-3,4-dihydropyrrolo [1,2-d][1,2,4]-yl) methyl]-2-fluoro-benzoic acid(6d) were obtained by the reaction of 6a with NCS(1 eq. or 2 eq.). Thirteen novel PARP-1 inhibitors(8a～8m) with pyrazolotriazinone skeleton were synthesized by the condensation reaction of 6a～6d, 6a～6c with 7a～7c or 1-(2-pyrimidyl) piperazine, using TBTU as condensation agent and DIPEA as base. The structures were characterized by1H NMR and MS(ESI). The inhibition activities(IC50) of 8a～8m against tumor cells MDA-MB-436 were investigated by the Alarm blue method. The results indicated that 8f, 8g, 8i and 8j exhibited well activities with IC50of 30.5～69.3 nmol·L-1.

benzonitrile; pyrazolotriazinone; PARP-1 inhibitor; synthesis; biological activity

2016-11-02

国家自然科学基金资助项目(81302650); 江苏高校优势学科建设工程资助项目

刘志雄(1991-)，男，汉族，江西吉安人，硕士研究生，主要从事药物合成的研究。 E-mail: m15195758151@163.com

于海涛,博士，讲师， E-mail: njubilly@njucm.edu.cn

O626; O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16280