多肽BRC4的固相法合成及其与RAD51(231-260)的相互作用

马 丽, 纪浩杰, 王 莹, 赵东欣, 卢 奎,2*

(1. 河南工业大学 化学化工学院,河南 郑州 450052; 2. 河南工程学院 材料与工程学院,河南 郑州 451191)

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多肽BRC4的固相法合成及其与RAD51(231-260)的相互作用

马 丽1, 纪浩杰1, 王 莹1, 赵东欣1, 卢 奎1,2*

(1. 河南工业大学 化学化工学院,河南 郑州 450052; 2. 河南工程学院 材料与工程学院,河南 郑州 451191)

采用Fmoc固相合成策略，以Wang树脂为载体，Fmoc保护的氨基酸为原料，HOBT/HBTU/DIEA 为缩合剂，经RP-HPLC分离纯化合成了3条多肽(BRC4, BRC4-1和BRC4-2)，纯度>90%，其结构经MS(ESI)确证。采用圆二色光谱研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2与蛋白RAD51关键肽段RAD51(231-260)的相互作用。结果表明：3条多肽与RAD51(231-260)的相互作用强度为BRC4-1>BRC4-2>BRC4。

Fmoc固相合成; 多肽; BRC4; RAD51; 相互作用

从分子角度研究癌症的致病机理是近年来生物医学领域的一个研究热点[1]。人体内天然存在的抑癌基因受到了研究人员的广泛关注。BRCA2是与乳腺癌相关的一种重要抑癌基因，位于人染色体13q12-q13上[2]。它通过调节RAD51蛋白，参与DNA同源重组。BRCA2与RAD51的相互作用主要通过其结构中的8个BRC重复基元(BRC1～BRC8)实现。其中BRC4是8个基元中与RAD51结合作用最强的基元[3-5]。BRC4含有35个氨基酸，数量较多，常规方法合成比较困难。固相合成法合成多肽具有合成时间短，成本较低和操作较简单等优点[6]，故本文尝试以固相合成法直链合成35肽。

BRC4的一级结构为KEPTLLGFHTASGKKVKIAKESLDKVKNLFDEKEQ(粗体部分为保守序列)，本文以Pellegrini等[7-10]对DNA重组中BRCA2-RAD51复合物的结构研究为基础，增加了序列中的芳香性氨基酸，将BRC4中1517-位的Lys突变为Phe。此外，由于Trp的侧链具有疏水性作用，可能会有益于其相互作用，而RAD51中的A4和A5螺旋形成的疏水口袋有足够的空间可以容纳有更大结构的BRC4中1545-位和1546-位氨基酸的残基，所以我们将1545-位的Leu换成含苯环的Trp，采用Fmoc固相合成策略和RP-HPLC分离纯化，设计并合成了BRC4及其两条类肽(BRC4-1和BRC4-2)，纯度>90%，其结构经MS(ESI)确证[11]。采用圆二色光谱研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2与蛋白RAD51关键肽段RAD51(231-260)的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Scientific LCQ Fleet型离子肼质谱仪(离子源：EI，检测模式：正离子，喷雾电压3.0 kV,毛细管温度300 ℃，毛细管电压33 V)； Agilent 1200型高效液相色谱仪[流动相：A相(0.1%TFA/H2O), B相(0.1%TFA/CH3CN)；梯度洗脱：20%～50%B, 0～35 min;液相色谱柱:Agilent Zorbax 300 SB-C18(9.4 mm×250 mm, 5 μm)；柱温25 ℃；流速1.0 mL·min-1；检测波长250～280 nm]； Bio-logic MOS-500型圆二色光谱仪；Thermo Scientific Sorvall Legend RT+型台式离心机；FF 210型多肽固相合成管。

Fmoc-Gln(Trt)-Wang Resin(担载量0.32 mmol·g-1), RAD51(231～260),纯度95%, Fmoc保护的氨基酸, 1-羟基苯并三唑(HOBT), 苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU),上海吉尔生化公司；哌啶,N,N-二异丙基乙胺(DIPEA),国药化学试剂有限公司；苯甲硫醚,乙二硫醇,三氟乙酸(TFA)，萨恩化学有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 BRC4～BRC4-2的合成(以BRC4为例)

(1) 树酯溶胀

在多肽合成管中加入Fmoc-Gln(Trt)-Wang Resin 1.5 g和DMF 10 mL，通氮排氧，搅拌30 min使树脂充分溶胀，抽滤得溶胀的树脂A。

(2) 脱除氨基保护基

在固相合成管中加入20%哌啶的DMF(10 mL)溶液和A，通氮排氧，搅拌30 min使A脱除氨基保护基，抽滤，滤饼用DMF(4×10 mL)洗涤1 min得脱除氨基保护基的树脂B。

(3) 茚三酮检测

在装有5%茚三酮的EtOH(2 mL)溶液的试管中加入B，煮沸3 min[若B变色则说明脱除完全，否则需重复(2)中步骤]。

(4) 偶联

在反应瓶中加入Fmoc-Glu(OBut)-OH 0.816 g, HOBT 0.259 g, HBTU 0.728 g和DMF 10 mL,搅拌使其溶解；于室温活化10 min，加入DIPEA 334 μL，混合均匀后加入固相合成管中，加入B，通氮排氧，避光搅拌4 h。依次用DMF(2×10 mL)，甲醇(2×10 mL)，和DMF(2×10 mL)洗涤1 min得偶联树脂C。

(5) 茚三酮检测

取少量C加入装有茚三酮的试管中，煮沸3 min[若树脂不变色则说明偶联成功，否则需重复(4)中步骤]。

(6) 树脂切割

在圆底烧瓶中加入用氮气吹干的复合物，按树脂1 g/切割试剂10 mL的比例加入切割试剂[V(TFA) ∶V(苯甲硫醚) ∶V(乙二硫醇) ∶V(水) ∶V(苯酚)=82.5 ∶5 ∶2.5 ∶5 ∶2.5]15 mL，于室温搅拌4 h。抽滤，滤液倒入冰乙醚中，放置冰箱过夜，离心，收集沉淀，吹干后经RP-HPLC纯化得白色固体BRC4。

用类似的方法合成白色固体BRC4-1和BRC4-2粗肽。

BRC4: 收率69%，纯度90%; MS(ESI)m/z: 1 320.00{[M+3H]3+}, 989.21{[M+4H]4+}, 791.32{ [M+5H]5+}, 660.12{[M+6H]6+}。

BRC4-1: 收率71%，纯度91%; MS(ESI)m/z: 1 326.00{[M+3H]3+}, 994.92{[M+4H]4+}, 796.25{ [M+5H]5+}, 663.67{[M+6H]6+}。

BRC4-2: 收率71%，纯度91%; MS(ESI)m/z: 1 344.48{[M+3H]3+}, 1 008.61{[M+4H]4+}, 807.01{ [M+5H]5+}, 672.74{[M+6H]6+}。

1.3 BRC4～BRC4-2与RAD51(231～260)的相互作用测定

(1) 在两个3 mL比色皿中分别加入2.85×10-6mol·L-1靶肽溶液和0.01 mol·L-1Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)2.5 mL，以Tris-HCl作参比，测定圆二色光谱。

(2) 在(1)中的两个比色皿中分别滴加5.05×10-4mol·L-1BRC4～BRC4-2溶液15 μL直至CD信号稳定，静置60 min，测定圆二色谱。

2 结果与讨论

2.1 相互作用的二级结构变化[12-13]

图1为BRC4～BRC4-2与RAD51(231-260)相互作用的圆二色谱图。表1为经CDPro计算，BRC4～BRC4-2与RAD51(231～260)相互作用后的二级结构变化。

λ/nm图1 BRC4～BRC4-2与RAD51(231-260)相互作用的 圆二色谱图Figure 1 The circular dichroism spectra of BRC4～ BRC4-2 interaction with RAD51(231-260)表1 BRC4～BRC4-2与RAD51(231～260) 相互作用后的二级结构变化Table 1 The secondary structure of BRC4～ BRC4-2 interaction with RAD51(231～260)

Compα-helix/%β-shee/%β-turn/%其他/%BRC4-RAD51(231-260)55.95.417.424.3(BRC4-1)-RAD51(231-260)56.15.817.422.8(BRC4-2)-RAD51(231-260)56.05.617.922.2

由图1可以看出，BRC4-1和BRC4-2与RAD51(231～260)相互作用后，190 nm处的正吸收峰和230 nm处的负吸收峰均比BRC4与RAD51(231～260)相互作用后的吸收峰显著增强，其中BRC4-1增强最为显著。

由表1可以看出，BRC4-1和BRC4-2与RAD51(231-260)的α螺旋、β折叠的比例均比BRC4略有增加，其中BRC4-1增加最明显。α螺旋、β折叠增加表明复合物结构有序性增加，相互作用增强，说明BRC4中的 Lys和Leu 被 Phe和Trp 替代后，与 RAD51(231～260)之间的作用均增强。BRC4-1与RAD51(231～260)相互作用最强的可能原因为： BRC4-1中的Phe取代了BRC4中的Lys后，产生了π-π堆积作用，BRC4-2中的Trp取代了BRC4中的Leu， Trp的侧链和 RAD51(231～260)中 Phe与Tyr 虽然也产生了π-π堆积作用，但可能因为取代位置位于肽段尾部，相互作用较弱。此外，Trp的残基中含有苯环，与Phe残基中的苯环形成位阻效应，导致RAD51(231～260)的A4和A5形成的疏水口袋结合得不够紧密。

采用Fmoc固相合成策略，合成了3条多肽(BRC4, BRC4-1和BRC4-2)，纯度>90%。采用圆二色光谱研究了BRC4, BRC4-1和BRC4-2与蛋白RAD51关键肽段RAD51(231-260)的相互作用。结果表明：3条多肽与RAD51(231-260)的相互作用强度为BRC4-1>BRC4-2>BRC4。该结果对多肽类药物的设计与合成有一定借鉴意义。

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Solid-phase Synthesis of Polypeptides BRC4 and Their Interaction with RAD51(231-260)

MA Li1, JI Hao-jie1, WANG Ying1, ZHAO Dong-xin1, LU Kui1，2*

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China;2. School of Materials and Engineering, Henan Institute of Engineering, Zhengzhou 451191, China)

Three polypeptides(BRC4, BRC4-1 and BRC4-2), with over 90% purity, were synthesized by the Fmoc solid synthesis strategy then separation and purification by RP-HPLC, using Wang resin as carrier, Fmoc protected amino acid as material and HOBT/HBTU/DIEA as coupling reagents. The structures were confirmed by MS(ESI). The interactions of BRC4, BRC4-1 and BRC4-2 with RAD51 were investigated by circular dichroism. The circular dichroism results showed that the sequence of interaction strength with RAD51(236-260) was BRC4-1>BRC4-2>BRC-4.

Fmoc solid phase synthesis; polypeptide; BRC4; RAD51; interaction

2016-08-25;

2017-01-10

国家自然科学基金资助项目(21172054, 21572046); 河南省教育厅自然科学基金资助项目(14A150017)

马丽(1975-)，女，汉族，河南郑州人，博士，副教授，主要从事化学生物学的研究。 E-mail: mamarry@haut.edu.cn

卢奎，教授， E-mail: luckyluke@haut.edu.cn

O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.02.16216