紫檀芪对C6胶质瘤细胞凋亡及Caspase—3活性的影响

阮升　顾志成　张世华

【摘要】 目的：研究紫檀芪（pterostilbene，PTE）体外抑制C6胶质瘤细胞增殖并诱导其凋亡的作用，探讨其可能的作用机制。方法：运用MTT法测定细胞存活率，吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双荧光染色观察C6细胞凋亡形态学变化，酶联免疫吸附法（ELISA）测定Caspase-3活性变化，并用Western blot法检测Fas、FasL蛋白的表达水平。结果：由MTT结果知紫檀芪可以显著抑制C6细胞的增殖（P<0.01），呈现药物浓度与时间依赖性；AO/EB荧光染色（24 h）可见典型的凋亡形态学特征；酶联免疫吸附（ELISA）检测表现为随PTE浓度升高，Caspase-3活性逐步升高（P<0.01）；Western blot检测显示PTE可以使Fas、FasL蛋白表达显著增加（P<0.01）。结论：PTE可诱导胶质瘤细胞系C6细胞凋亡，其作用机制可能与激活Fas/FasL通路、上调Caspase-3活性有关。

【关键词】 紫檀芪； 胶质瘤细胞； 细胞凋亡； Fas/FasL； Caspase-3

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of pterostilbene（PTE） on the proliferation and apoptosis of glioma cell C6 in vitro，to probe into its mechanism.Method：MTT method was used to detect the survival rate of cells，using AO/EB fluorescent staining methods to observe apoptotic morphological changes of C6 cells.The enzymatic acitivity of Csapase-3 was measured by ELISA.The protein levels of Fas and FasL were detected by Western blot.Result：MTT result showed that PTE can effectively inhibit the proliferation of C6（P<0.01），these effects were showed to be time-and dose-dependent.The result of AO/EB fluorescent staining（24 h） showed that C6 treated by PTE was seen typical apoptotic morphological features.Besides，the enzymatic activity of Csapase-3 was promoted obviously after the effect of PTE on C6 cells by ELISA（P<0.01）.The result of Western blot showed that the protein levels of Fas and FasL in the C6 were upgraded significantly（P<0.01）. Conclusion：PTE can induce apoptosis of glioma cell C6，which is concerned with upgrading Fas and FasL，thereby affecting activation of apoptotic factor Caspase-3 protein.

【Key words】 Pterostilbene； Glioma cells； Apoptosis； Fas/FasL； Caspase-3

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.005

脑胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发病率及死亡率居颅内肿瘤之首，具有无控增殖、侵润生长、易复发等特点[1-2]。目前脑胶质瘤的治疗方案主要是以手术切除为主，化疗及放疗为辅，尽管综合以上各种治疗手段，但胶质瘤患者的中位生存期并无明显改善，患者大多于明确诊断后1年内死亡[3]。近年来，一些天然物质（ 青蒿琥酯、白藜芦醇、雷公藤内酯醇等）被逐渐应用于肿瘤的防治，其优异的效果使人们越来越重视天然药物在抗肿瘤方面的研究与应用[4-7]。目前关于白藜芦醇抗肿瘤的研究很多，其可抑制多种恶性肿瘤细胞的生长[8-9]。紫檀芪（pterostilbene，PTE）作为白藜芦醇的甲基化衍生物，与白藜芦醇相比，具有更高的的生物活性[10]，更好的安全性[11]。关于PTE治疗脑胶质瘤的研究国内外目前尚无报道，本研究将以体外培养的脑胶质瘤C6细胞系作为研究对象，观察PTE对其增殖及凋亡的影响，从而为临床药物治疗脑胶质瘤提供新的思路与方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠脑胶质瘤C6细胞株（上海拜力生物科技有限公）；PTE（南京世洲生物科技有限公司，纯度>99%），用DMSO溶解。DMEM培养基，0.25%胰酶和胎牛血清（Hyclone公司）；四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）（上海碧云天生物技术有限公司）；Fas、FasL抗体（北京中杉公司）；β-actin 抗体（北京中杉公司）；大鼠Caspase-3 Elisa试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）。Allegra 64R超低溫高速离心机（Beckman公司）；Synergy HT全自动酶标仪（Bio-Tek公司）；Tanon 5200图像分析管理系统（上海天能科技有限公司）；激光共聚焦显微镜（OLYMPUS）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将C6细胞用完全培养基（DMEM培养基、10%胎牛血清及1%双抗）置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养至对数期备用。

1.2.2 MTT法检测PTE对C6细胞增殖的抑制作用 调整细胞浓度为5×107/L，96孔培养板中每孔加入100 μL，待其贴壁后，再加入PTE溶液100 μL，使PTE终浓度为10、20、40 μmol/L，对照组加入同体积含0.01%DMSO的完全培养基，分别培养24、48、72 h，加20 μL的MTT，4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，在37 ℃恒温摇床上震荡10 min，酶标仪570/630 nm处测定各组OD值。

1.2.3 AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡 C6细胞以3×107/L的浓度铺100 μL于激光共聚焦培养皿，4 h后弃掉旧培养液，加入不含胎牛血清的DMEM培养基，继续培养4 h后，加入PTE（分组同1.2.2）继续培养24 h。吸弃原培养液，用PBS洗涤3遍，加入AO/EB 双荧光染色液100 μL（AO、EB的终浓度为5 μg/mL）。染色8 min后，吸弃染液，加PBS洗涤3遍，于激光共聚焦显微镜下观察并记录。

1.2.4 Caspase-3活化程度的测定 取实验组和对照组细胞（分组同1.2.2）：用PBS洗涤2遍，离心（1200 r/min，3 min）收集的沉淀后加入裂解液，在冰上超声裂解细胞后，于4 ℃，12 000 r/min离心10 min，吸取上清液备用。按BCA试剂盒说明书操作，计算各组中的蛋白浓度，取100 μL含150 μg蛋白的样品，加入反应缓冲液100 μL，再加入10 μL Caspase-3荧光底物于恒温箱中培养4 h，在405 nm波长测定其OD值。

1.2.5 Western blot检测Fas、FasL蛋白表达 以细胞密度为5×107/L， 接种于培养皿中，加入PTE（分组同1.2.2），培养24 h后，裂解细胞，按BCA试剂盒检测样品蛋白的浓度后，按30 μg体系加样，垂直电泳，270 mA电转膜70 min，封闭50 min，一抗孵育过夜，二抗孵育60 min，加入ECL发光液，Tanon 5200采集图像，并对Western blot结果进行灰度扫描。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测定PTE对C6细胞增殖的影响 不同浓度PTE（ 10、20、40 μmol/L） 培养24、48、72 h后细胞存活率结果，见表1。由10、20、

40 μmol/L的PTE对C6细胞作用48 h的抑制率分别为（45.88±0.74）%、（52.37±1.59）%、（63.97±1.47）%，可见随着药物浓度的升高，抑制作用逐渐增强，同时24、48、72 h半数抑制浓度（IC50）分别为75.2、14.6、4.8 μmol/L，显示随着作用时间延长，抑制作用逐渐增强。上述结果表明PTE可以有效抑制C6细胞的增殖，结果呈浓度时间依赖性。

2.2 激光共聚焦观察C6细胞核形态改变 经AO/EB

荧光染色后，对照组的细胞核染色质均被染成绿色，深浅不一致，同时细胞核仍呈正常形态；经10、20 μmol/L PTE处理24 h后细胞大多核染色质染成绿色，染色增强，荧光更为明亮，呈固缩状或圆珠状，体积也较对照组的细胞大，为早期凋亡细胞；经40 μmol/L PTE处理24 h后，有些细胞核染色质被染成橘红色，碎裂散布于胞浆中，细胞膜完整性遭到破坏，这些为晚期凋亡细胞。见图1。随着药物浓度的增加，橘红色荧光增强，被染细胞核的比例也随之增高，同时细胞数目随着减少，呈典型的凋亡特征。

2.3 PTE对C6 细胞中Caspase-3活性影响 各浓度PTE组C6 细胞Caspase-3蛋白含量较对照组明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见表2。

2.4 Western blot检测Fas、FasL的表达 Fas和FasL表达的蛋白水平随着PTE浓度增加而增加，同时各指标在各组间表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.01），见图2，即PTE诱导 Fas和FasL蛋白的表达呈现剂量依赖性。

3 讨论

脑胶质瘤的发生演化与细胞调控增殖、分化、凋亡三者的平衡失调相关联，是由多个基因、多个步骤、多个阶段的共同作用[12]，其中细胞增殖与凋亡的平衡失调在脑胶质瘤发生过程中可能起著十分重要的作用[13]。有学者提出启动肿瘤细胞自身凋亡机制，诱导肿瘤细胞凋亡对肿瘤治愈有重要的意义[14-15]。目前在哺乳动物中存在着内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径这两条细胞凋亡途径[16]。而Caspase-3是这2条信号途径的关键通道，它的表达增加及活化标志着细胞启动了凋亡机制[17]。Fas/FasL是肿瘤细胞中广泛存在且极为重要的受体[18]，作为体内介导细胞凋亡的一对糖蛋白分子，在肿瘤发生、发展过程中具有重要作用[19]，Fas与FasL配体结合后可通过 Fas分子启动膜受体途径信号，激活Caspase-3，最终启动细胞凋亡信号途径[20]。

PTE作为一种天然物质，具有明确的抗肿瘤效应，与传统的抗肿瘤药物相比，其安全范围很大，基本无不良反应[10-11]，同时具有较好的脂溶性，极易通过血脑屏障[21]。有研究显示PTE能通过线粒体途径和死亡受体途径传递凋亡信号，多靶点诱导细胞凋亡，最终发挥其抗肿瘤效应[22]。但是在不同的肿瘤细胞中，其具体作用方式及作用靶点仍不甚清楚。有学者指出PTE能通过促使线粒体膜电位去极化及上调Caspase-3活性来诱导人乳腺癌细胞凋亡[23]。

本實验经AO/EB荧光染色法观察到C6细胞核中可见典型的凋亡形态学特征。MTT的结果呈现出PTE对于C6胶质瘤细胞的增殖抑制具有时间及浓度依赖性。为了进一步探讨PTE诱导C6细胞凋亡的具体作用方式，对Caspase-3酶活性及Fas、FasL蛋白的表达进行了检测：PTE作用于C6细胞24 h后Caspase-3活性显著上升（P<0.01），Fas、FasL蛋白表达明显增加（P<0.01）。由此推断，PTE诱导C6细胞凋亡的作用与调控死亡受体途径的相关蛋白的表达存在一定的联系。同时，可进一步提出猜想PTE能否干扰线粒体膜的稳定性，并围绕线粒体凋亡途径是否也参与了PTE诱导C6胶质瘤细胞凋亡进程，开展进一步的深入研究。

综上所述，PTE可能通过激活Fas/FasL通路，活化Caspase-3，从而抑制胶质瘤细胞增殖并诱导其凋亡。基于本实验研究成果，PTE在脑胶质瘤药物治疗领域中有很高的研究价值及开拓前景。

参考文献

[1] Alves T R，Lima F R S，Kahn S A，et al.Glioblastoma cells：A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma[J].Life Sciences，2011，89（15-16）：532-539.

[2] Kettenmann H，Hanisch U K，Noda M，et al.Physiology of microglia[J].Physiological Reviews，2011，91（2）：461-553.

[3] Bao S，Wu Q，McLendon R E，et al.Glioma stem cells promote radior-esistance by preferential activation of the DNA damage response[J].Nature，2006，444（7120）：756-760.

[4] Stakleff K S，Sloan T，Blanco D，et al.Resveratrol exerts differential effects in vitro and in vivo against ovarian cancer cells[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp，2012，13（4）：1333-1340.

[5] Harikumar K B，Aggarwal B B.Resveratrol： a multitargeted agent for age-associated chronic diseases[J].Cell Cycle，2008，7（8）：1020-1035.

[6] Vergara D，Valente C M，Tinelli A，et al.Resveratrol inhibits the epidermal growth factor-induced epithelial mesenchymal transition in MCF-7 cells[J].Cancer Letters，2011，310（1）：1-8.

[7] Piotrowska H，Myszkowski K，Zió?kowska A，et al.Resveratrol analogue 3，4，4 ，5-tetramethoxystilbene inhibits growth， arrests cell cycle and induces apoptosis in ovarian SKOV-3 and A-2780 cancer cells[J].Toxicology & Applied Pharmacology，2012，263（1）：53-60.

[8] Frazzi R，Valli R，Tamagnini I，et al.Resveratrol-mediated apoptosis of hodgkin lymphoma cells involves SIRT1 inhibition and FOXO3a hyperacetylation[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer，2013，132（5）：1013-1021.

[9] Rimando A M，Cuendet M，Desmarchelier C，et al.Cancer chemopreventive and antioxidant activities of pterostilbene， a naturally occurring analogue of resveratrol[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2002，50（12）：3453-3457.

[10] Ruiz M J，Fernández M，Picó Y，et al.Dietary administration of high doses of pterostilbene and quercetin to mice is not toxic[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2009，57（57）：3180-3186.

[11] Chang J，Rimando A，Pallas M，et al.Low-dose pterostilbene，but not resveratrol，is a potent neuromodulator in aging and Alzheimer's disease[J].Neurobiology of Aging，2012，33（9）：2062-2071.

[12] Huse J T，Holland E C.Targeting brain cancer： advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma[J].Nature Reviews Cancer，2010，10（5）：319-331.

[13]马瑞敏，康熙雄，杨春娇，等.脑胶质瘤恶性进展关键miRNA表达的研究[J].检验医学与临床，2016，13（9）：1184-1186.

[14]郑立影，呂红，林赋桂，等.脑胶质瘤治疗策略及其研究进展[J].吉林医药学院学报，2016，37（1）：50-53.

[15]綦晓艳，王文武，欧阳学农.DR4、DR5甲基化影响肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展[J].实用临床医药杂志，2015，19（1）：156-160.

[16] Strasser A，Cory S，Adams J M.Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of cancer and other diseases[J].Embo Journal，2011，30（18）：3667-3683.

[17] Mcilwain D R，Berger T，Tw M.Caspase Functions in Cell Death and Disease： Figure 1[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2013，5（4）：962-968.

[18]王耀先，郝慧南，陈秀玮，等.大黄素通过内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的研究[J].中国中医药科技，2013，20（1）：37-39.

[19] Chen L，Park S M，Tumanov A V，et al.CD95 promotes tumour growth[J].Nature，2010，465（7297）：492-496.

[20] Jian X，Cheng G，Tang H F，et al.Ardipusilloside I induces apoptosis in human glioblastoma cells through a caspase-8-independent FasL/Fas-signaling pathway[J]. Environmental Toxicology & Pharmacology，2009，27（2）：264-270.

[21] Foti C V，Ciurleo R，Giacoppo S，et al.Role of resveratrol and its analogues in the treatment of neurodegenerative diseases： focus on recent discoveries[J].Cns & Neurological Disorders Drug Targets，2011，10（7）：849-862.

[22]王燕山，丁凌，王晓稼.紫檀芪的抗肿瘤活性研究进展[J].国际肿瘤学杂志，2011，38（3）：189-191.

[23] Schneider J G，Alosi J A，Mcdonald D E，et al.Effects of pterostilbene on melanoma alone and in synergy with inositol hexaphosphate[J].American Journal of Surgery，2009，198（5）：679-684.

（收稿日期：2016-09-01） （本文编辑：程旭然）