紫杉醇白蛋白纳米粒的研究现状与进展

陈东晓，张娟梅，李建业，徐天宏，董亚琴，蒲晓辉

1.河南大学 药学院，河南 开封，475004； 2. 南京拉克森生物医药科技有限公司，南京，211100

紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉科红豆杉属(Taxus)植物的树皮中提取得到的二萜类化合物。纯品紫杉醇为白色结晶粉末，分子式为C47H51NO14，相对分子质量为853.92，具有高度的亲脂性，易溶于氯仿、乙醇等有机溶剂，难溶于水[1]。经临床验证，紫杉醇具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效，被认为是人类未来20年间最有效的抗癌药物之一。但紫杉醇难溶于水的性质严重阻碍了其在临床治疗中的应用。为了解决其在静脉注射中的难题，人们不得不在注射剂中加入表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL，Cr EL)。目前在临床最为常用的Taxol为6 mg/mL 的紫杉醇混合于Cremophore EL及无水乙醇(1∶1)媒介中。市售的紫杉醇注射液Taxol由于含有大量的表面活性剂Cr EL，毒性很大，进入体内容易发生溶血，出现严重的过敏反应[2]。

白蛋白纳米粒是以白蛋白为基质的纳米级微粒。白蛋白属于内源性天然产物，具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点。而且纳米粒载体系统又具备独特的靶向性、缓控释特性和保护药物作用[3]。因此，将白蛋白纳米粒运用于紫杉醇的体内传递与癌症治疗已成为近年来研究的热点。通过将内源性白蛋白与紫杉醇的结合，所制得的纳米粒子不仅克服了紫杉醇难溶于水的缺点，也避免了使用Cr EL和吐温80等辅料带来的毒副作用。同时，其载药量显著高于Taxol，且具有一定的缓释效果，具备更好的抗肿瘤疗效。目前，已经上市并临床用于乳腺癌治疗的紫杉醇白蛋白混悬液(Abraxane)，以其良好的生物相容性，可生物降解、无免疫原性，以及更好的抗肿瘤效果，为临床上癌症的控制与治疗提供了有效的解决方案。

我们主要通过对紫杉醇白蛋白纳米粒子的制备工艺、作用机制、靶向修饰以及临床应用等方面的分析与比较，概括总结紫杉醇白蛋白纳米粒的研究现状与进展，为研究者们下一步的研究提供一定的理论与经验基础。

1 作用机制

1.1 紫杉醇的抗肿瘤机制

紫杉醇主要作用于微管蛋白。微管蛋白是所有真核细胞中构成细胞骨架的成分，也是细胞分裂过程中组成纺锤体的重要成分。紫杉醇通过诱导和稳定微管蛋白聚合并抑制其正常的生理性解聚，使细胞中微管蛋白含量增多。在细胞分裂过程中，微管蛋白的增多会导致纺锤体微管的减少，纺锤丝与纺锤体无法形成，从而使癌症细胞的分裂永远停留在G2和M期，导致其无法复制，最终使其凋亡[4]。

1.2 白蛋白纳米粒的内吞机制

对于白蛋白纳米粒的内吞机制，目前的研究结果大多认为分为两个阶段：首先，白蛋白纳米粒被注入到人体后，经血液循环到达肿瘤部位，一部分经EPR效应流入肿瘤组织，大多数是利用白蛋白激活内皮细胞表面的gp-60受体，使内皮细胞凹陷成窝从而将纳米粒转运至肿瘤细胞间隙[5]。然后，细胞间隙的白蛋白纳米粒进一步由SPARC(富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白)介导进入肿瘤细胞，实现肿瘤细胞的内吞，药物在肿瘤细胞内被释放，从而起到抗肿瘤疗效[6]。

2 白蛋白纳米粒的制备方法

经研究，药物与白蛋白之间的结合以静电作用和疏水作用为主。制备的方法一般有去溶剂化法、pH凝聚法、快速膨胀超临界溶液法、机械研磨法、基于二硫键形成法的 nabTM技术以及热凝胶化法。

2.1 去溶剂化法

通过脱水剂的去溶剂化作用除去白蛋白的水化膜，使白蛋白析出，辅以搅拌，再用交联剂与白蛋白发生交联反应使之变性，从而稳定白蛋白纳米粒，然后纯化除去残留的交联剂和有机溶剂。其中，交联剂多采用戊二醛，脱水剂多用乙醇或丙酮等。采用丙酮为脱水剂的固化温度低、 时间短，可用于包埋温度敏感的药物[7]。

2.2 pH凝聚法

在制备白蛋白纳米粒子的过程中，改变白蛋白溶液的pH值、浓度以及交联剂的用量，来制备得到形态均一、粒径稳定的白蛋白纳米粒子。Merodio等曾对其制备方法进行过对比，发现以pH凝聚法制得的白蛋白纳米粒具有更好的控释效果[8]。

2.3 快速膨胀超临界溶液法

Meziani等于2003年报道了将生物材料与无机物偶联形成蛋白纳米粒的方法：快速膨胀超临界溶液法，并制备得到了硫化银-BSA纳米粒。该法主要是以超临界流体(如CO2)为溶剂，将模型药物溶于其中。施加压力并通过小孔后其溶液快速膨胀，溶剂挥发，溶质迅速喷入到白蛋白溶液当中即制得相应的载药白蛋白纳米粒子。之后经过离心、沉淀等手段可以分离得到较纯净的纳米粒子。其中，膨胀压力、加热温度以及喷嘴孔径的大小对粒子的粒径及分布影响较大，可以对其进行适当调整来满足实验要求[9]。

2.4 机械研磨法

何治柯等发明了制备水溶性CdSe/ZnS白蛋白纳米粒的方法，将分散于正己烷中ZnS 包覆的CdSe 核壳型量子点用甲醇沉淀、洗涤、干燥后再分散于正己烷溶液，将牛血清白蛋白与量子点的正己烷溶液一起放入研钵，适度研磨混匀，待正己烷挥发后加入PBS缓冲液洗涤再分散，让白蛋白与纳米粒进一步作用后，离心上层液即为白蛋白包裹的CdSe/ZnS纳米粒[10]。

2.5 基于二硫键形成法的NabTM技术

该法主要利用了白蛋白带有巯基或二硫键基团。首先，分别将难溶性药物与白蛋白溶于有机相与水相中，将二者混合。然后，在高剪切力下，液体内产生气穴空化作用，引起局部高热，使得白蛋白中巯基或二硫键断裂，同时有机溶剂快速挥发，并在白蛋白内/间交联形成新的二硫键，从而在非水性介质微小液滴(如水不溶性药物)的周围形成一个交联的聚合物壳体。该法制备得到的纳米粒子生物相容性好，可生物降解，并且其粒径分布较小，避免了高压灭菌带来的蛋白质变性问题。但该法中使用了氯仿等毒性较大的有机溶剂，而且其制备周期及操作要求较高，不利于大规模机械化生产[11]。

2.6 热凝胶化法

热凝胶化法是利用白蛋白受热凝胶化而自发形成纳米粒子的方法。相较于上述几种方法，该法在制备过程中未引入任何有机溶剂，避免了有机溶剂未完全除去的安全隐患。另外，该法操作简单，对仪器设备要求较低，因此成本较低，有利于其在临床上的广泛应用[12]。

3 白蛋白纳米粒子的表面修饰策略

白蛋白纳米粒子多以物理包埋的方式制备得到。该类方式制备得到的纳米粒子不仅能够保护药物不受外界环境因素的影响，还能够提高药物的稳定性。另外，通过调整工艺中的投料比、改变温度及反应时长等因素，可以有效地控制制得的纳米粒子的粒度大小，从而使其能够依赖EPR效应达到肿瘤靶向的目的。由于白蛋白表面具有很多的活性氨基，应用白蛋白表面活性基团与药物偶联，吸收进入体内后，连接的化学键在体内酶的作用下断裂，即可实现提高药物溶解性、缓释以及靶向的目的。常见的针对氨基的修饰有以下几种。

3.1 PEG修饰

将适宜分子量的PEG共价结合到白蛋白的活性氨基上，从而提高其亲水性，以避开巨噬细胞的吞噬作用。有研究者对多西紫杉醇白蛋白纳米粒作了PEG修饰，目的是避开肝脏的巨噬细胞，从而使其转运至肺组织发挥抗肿瘤效果。从实验结果可以看出，相比于未经修饰的纳米粒，PEG化的白蛋白纳米粒表现出更强的缓释效果以及更长的体内滞留时间[13]。

3.2 疏水性修饰

对白蛋白氨基进行疏水性修饰，使其具有两亲性，进而向纳米胶束方向转变。烷基化后形成的白蛋白纳米胶束具有更小的粒径范围，提高了制剂的被动肿瘤靶向能力。但实验结果证明，烷基化的疏水链长度应加以控制，否则打破两亲性平衡后易出现纳米胶束的聚沉[14]。

3.3 结合细胞特异性受体信号

结合细胞特异性受体，例如将氨基半乳糖化，使其能被肝癌细胞特异性识别，从而使其具有一定的肝靶向能力[15]。

3.4 叶酸修饰

针对肿瘤组织处细胞表面丰富的叶酸受体这一特性，对氨基进行叶酸修饰，可提高载药白蛋白纳米粒子的肿瘤靶向能力。张良珂等人对以叶酸偶联修饰得到的牛血清白蛋白纳米粒进行了肿瘤靶向性研究。首先，在碱性条件下使叶酸活性酯与牛血清白蛋白纳米粒偶联得到目的产物，然后以荧光定量法实时监测肿瘤细胞对其的摄取情况。结果显示，叶酸修饰得到的白蛋白纳米粒在肿瘤细胞摄取量与其浓度和培养时间成正比，该摄取活动在高浓度叶酸环境中可以被抑制[16]。

3.5 抗体-抗原介导

采用抗体-抗原介导系统，对白蛋白表面活性氨基做免疫抗体偶联修饰，实现其特异性免疫介导的靶向给药目的。刘娅妮等人设计并制备得到了VCAM-1单克隆抗体修饰的白蛋白微气泡，并用其培养损伤细胞(细胞表面VCAM-1抗原高度表达)和正常细胞。最终结果表明，抗体修饰后的白蛋白纳米粒大量聚集于损伤细胞周围，而正常细胞无此现象。这证明了抗体-抗原介导的白蛋白给药系统具有更加优异的靶向能力[17]。

3.6 磁靶向修饰

信涛等人曾以去溶剂法制备得到了阿霉素白蛋白磁性纳米粒子，并以肝癌小鼠为模型，以外加磁场与栓塞供血动脉为动力，考察了其在动物体内的组织学分布。结果显示，磁性纳米粒具有更好的肿瘤集聚能力，且联合给药使得进入血液循环的药物减少，从而降低了阿霉素的毒副作用[18]。

4 紫杉醇白蛋白纳米粒的临床应用

用于临床上治疗肿瘤的传统紫杉醇注射剂，在溶解时使用了表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油。因聚氧乙烯蓖麻油可使肥大细胞脱颗粒，释放组胺引起过敏反应，发生率高达25%～30%，严重者可致人死亡[19]。所以，该剂型具有严重的毒副作用，在临床使用前必须进行抗过敏药物与糖皮质激素的处理。而紫杉醇白蛋白纳米粒子的制备不涉及合成材料，也并未使用聚氧乙烯蓖麻油等毒副作用较强的增溶剂，因此在临床使用前无需进行相关的预处理。另外，白蛋白纳米粒的内吞机制也使其在相同浓度下表现出比传统注射剂更强的抗肿瘤效果，使用紫杉醇白蛋白纳米粒在较低浓度下即可达到相应的治疗效果。这就可以有效地避免紫杉醇在高浓度下诱导产生的周围感觉神经病变[20]。

目前，已上市使用的紫杉醇白蛋白纳米粒混悬剂被研究证明在卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌以及前列腺癌等癌症的治疗过程中均具有一定的疗效。

2015年，江浩等人设计并进行了白蛋白结合型紫杉醇与传统注射型紫杉醇在卵巢癌治疗上的疗效对比实验。该实验以小鼠构建卵巢癌模型，通过比较在相同的毒性剂量下小鼠的死亡率以及肿瘤增长速率来证实白蛋白结合型紫杉醇的用药安全性。结果显示，给药白蛋白组小鼠的存活率与肿瘤抑制率显著高于紫杉醇注射剂组。另外，临床研究表明白蛋白结合型紫杉醇对复发型卵巢癌具有明显的疗效[21]。

2010年，李苏等人对24例乳腺癌患者进行了白蛋白纳米紫杉醇与传统溶剂型紫杉醇的疗效以及药代动力学对比。结果显示，相比于传统剂型，白蛋白纳米在进入人体后15 min即达峰浓度，且最高血药浓度是传统剂型的2～3倍。同时，二者治疗组均出现Ⅰ～Ⅲ血液学毒性，但比例为1∶2.5(白蛋白纳米与传统溶剂型)[22]。

在非小细胞肺癌的治疗上，目前多采用联合治疗的方案，即将白蛋白结合型紫杉醇与卡铂、培美曲塞、厄洛替尼等药物联用[23-25]。此法不仅能够显著提高对非小细胞肺癌的治疗作用，而且由化疗药物引起的毒副作用也明显减缓。其中，白蛋白结合型紫杉醇联合卡铂已于2012年被FDA批准用于非小细胞肺癌的一线治疗。而培美曲塞与厄洛替尼作为二线治疗药物与白蛋白结合型紫杉醇联用也表现出提高的治疗效果。

此外，紫杉醇对于胰腺癌与前列腺癌也有一定的治疗效果[26]。DD Von Hoff等在研究白蛋白结合型紫杉醇联合吉西他滨用于治疗胰腺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床实验中发现，联合治疗前后的有效率分别为17%与57%。另外，紫杉醇在治疗过程中副作用(如粒细胞减少、血小板减少及感觉神经毒性)的发生率也呈现出明显的下降趋势。T Kolevska等针对转移性前列腺癌做了白蛋白结合型紫杉醇的Ⅱ期临床研究。结果表明，该制剂用于治疗激素抵抗的转移性前列腺癌的临床收益率在68%以上，且不良反应可以耐受[27]。

5 总结

纳米粒子以其微小的粒径分布，能够比较容易地通过EPR效应富集于肿瘤部位，从而实现抗肿瘤药物的被动靶向治疗。而将内源性白蛋白用于构建纳米载药传递系统，不仅能够大大提高化疗药物的血药浓度，还可以利用白蛋白本身的亲和性避免机体自身的吞噬机制。通过肿瘤细胞膜表面特异性表达的受体以及肿瘤组织微环境的特异性，对白蛋白活性氨基进行适当的修饰，更能实现抗肿瘤药物的主动靶向治疗。目前已上市使用的注射用白蛋白结合型紫杉醇混悬剂，不仅大大提高了抗癌药物的肿瘤靶向作用，还显著减少了传统剂型中使用辅料以及高浓度下化疗药物本身所产生的毒副作用。多个地区及国家的临床治疗结果也显示出其相比于传统溶剂型紫杉醇更好的肿瘤治疗效果。从以上的概括总结可以看出，研究者们对将该剂型用于肿瘤的临床治疗抱有极大的信心，紫杉醇白蛋白纳米粒将在未来癌症的治疗中发挥越来越重要的作用。

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