白叶1号的低温抗逆特性分析

张兰，李鑫，魏吉鹏,2，李治鑫,2，沈晨,2，颜鹏，张丽平，韩文炎*



白叶1号的低温抗逆特性分析

张兰1，李鑫1，魏吉鹏1,2，李治鑫1,2，沈晨1,2，颜鹏1，张丽平1，韩文炎1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所，浙江杭州310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

比较了浙江省白化品种白叶1号返白阶段和主栽品种龙井43的低温抗性。结果表明，常温（25℃）环境下，返白期白叶1号反映光合能力的净光合速率Pn和最大羧化反应效率Vcmax都只有龙井43的70%~80%，而APX、POD等抗氧化酶活力比龙井43高30%以上。低温（2℃）处理24 h后，白叶1号反映光合能力的各项参数反而高于龙井43，同时其APX、POD、SOD活性也比龙井43分别高38.9%、33.3%、23.3%。说明白叶1号可能由于白化现象的产生，导致其抗氧化系统修复能力得到提高，因此在低温胁迫中，能够更为有效地清除叶片H2O2累积，缓解H2O2造成的氧化胁迫及光合抑制现象，具备比龙井43更好的低温耐受性。

白叶1号；返白；低温胁迫；抗氧化酶

白叶1号（cv.）是一种低温敏感型的茶树白化变异品种，其新梢发育过程中存在阶段性返白现象。成浩等[1]研究发现，白叶1号的返白现象主要受当年春季气温的影响并只在茶芽萌动期表现。在浙江杭州地区，白叶1号的白化时间一般从4月3日持续到4月27日，新叶颜色表现出浅绿色-乳白色-全白色的变化过程[2]。白叶1号的白化现象与品质正相关，在近25 d的白化现象发生期间，其一芽二叶的氨基酸含量比普通绿茶高1倍，但茶多酚含量仅为普通绿茶的1/2，故其滋味鲜爽、风味独特，正因此白叶1号茶深得消费者的喜爱及研究者的关注。研究表明，白叶1号叶色白化突变产生的机制非常复杂，受温度、光照等外界环境因素和基因、蛋白变化等内在因素的共同影响[3-4]。在多种调控途径和代谢过程发生变化的情况下，白叶1号的抗逆性是否受影响，是目前值得进一步探究的科学问题。

白叶1号春芽萌动至返白期间正是“倒春寒”天气易发生的时期（春季后期，一般4月）。“倒春寒”这种低温天气常对茶树的生长发育产生严重影响，致使刚萌发的春茶嫩芽被冻伤或冻死。光合作用是植物生长发育的基础，直接反映植物的生长状况，并且是受低温影响最明显的过程之一[5]。低温通常会造成茶树光合系统的损伤[6]，引起茶树细胞膜半透性的改变或丧失，细胞内的物质大量渗透，最终导致细胞死亡[7]，严重影响茶叶的产量和品质[8-9]。因此，结合生产实践，本研究以浙江一带主栽常规优质品种——龙井43为对照，以光合作用能力和抗氧化酶系统等为切入点，初步探讨了白叶1号返白阶段对低温胁迫的抗性响应，同时为白叶1号返白期的抗逆性研究提供数据积累。

1 材料与方法

1.1 实验材料与处理

采用中国农业科学院茶叶研究所玻璃温室培养的龙井43及白叶1号二年扦插苗为试验材料，于4月中旬白叶1号叶片返白期进行试验处理。取长势一致的两品种茶苗放入25℃的人工气候培养箱中预培养1 d，光照强度600 μmol·m-2·s-1，光周期12 h，昼夜温度25℃/17℃，湿度70%；之后各取一半数量的两品种茶苗放入低温（昼夜温度均为2℃）人工气候培养箱中处理，光照、光周期、湿度条件同上，24 h后对两个温度下的茶苗取样并进行相关指标的测定。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 光合气体交换

利用LI-COR 6400xt型便携式光合荧光测量系统在光照强度为600 μmol·m-2·s-1和CO2物质的量分数为400 μmol·mol-1下测定茶树叶片的净光合速率（Pn）及光合CO2响应曲线（）[10]。根据CO2响应曲线数据，参考Ethier等[11]的方法分析Rubisco最大羧化速率（Vcmax）及RuBP最大再生速率（Jmax）。

1.2.2 叶绿素荧光参数

利用IMAGING-PAM调制荧光成像系统测定荧光参数——最大光化学量子产量（Fv/Fm）。将测量光、光化光、饱和光的光强分别设定为<0.05、280、4 000 μmol·m-2·s-1。茶树植株暗适应20~30 min后开始测定。先获得暗适应下叶片的最小荧光Fo，然后打开饱和脉冲光（0.8 s）获得暗适应下叶片的最大荧光Fm。参数的计算根据Snel等[12]方法，具体计算公式如下：Fv/Fm=（Fm－Fo）/Fm。

1.2.3 DAB染色

将茶树叶片放入0.1%二甲基联苯胺（DAB）溶液中并置于25℃环境中光照4~6 h，待叶片上开始出现褐红色斑点即染色完毕。将叶片取出放置在95%乙醇中，沸水浴约15 min，更换95%乙醇再次沸水浴直至将叶片完全脱绿，保存到95%乙醇中后拍照。

1.2.4 抗氧化酶活性测定

提取方法：取0.3 g茶树液氮冻样，研钵磨成粉末，加3 mL磷酸缓冲液（50 mmol·L-1PBS，含0.2 mmol·L-1EDTA和2% PVP）提取，4℃，12 000 g，离心20 min，取上清液用于以下酶活性的测定。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定采用Nakano等[13]的方法，并有所改进。2 mL反应液中含1 700 μL 25 mmol·L-1PBS缓冲液(pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA)，100 μL 5 mmol·L-1AsA，100 μL酶液及100 μL 20 mmol·L-1H2O2，立刻测定OD290的动力学变化，测定时间间隔为40 s。

过氧化氢酶（CAT）活力测定参照Cakmak等[14]的方法，并有所改进。2 mL反应液中含1 700 μL的25 mmol·L-1PBS（pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA），100 μL酶液及200 μL 10 mmol·L-1H2O2，在25℃下反应，并立刻测定OD470的动力学变化，测定时间间隔为40 s。

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定采用Giannopolitis等[15]的方法，并有所改进。3 mL反应混合液中含50 mmol·L-1PBS（pH 7.8，含甲硫氨酸，NBT，核黄素及0.1 mmol·L-1EDTA），加入酶液50 μL。在25℃，光强100 μmol·m-2·s-1下光照10 min，然后置于黑暗环境中终止反应，测定OD560的吸光值。

过氧化物酶（POD）活力测定参照Cakmak等[14]的方法，并有所改进。2 mL反应液中含1 700 μL 25 mmol·L-1PBS缓冲液（pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA），100 μL酶液，100 μL 20 mmol·L-1H2O2及100 μL 1%愈创木酚，在25℃下反应，并立刻测定OD470的动力学变化，测定时间间隔为40 s。

1.2.5 数据分析

利用Excel 2010进行数据平均数、方差的计算，SPSS 20.0统计软件进行显著性差异分析，Origin7.5作图。

2 结果与分析

2.1 低温对龙井43和白叶1号净光合速率的影响

净光合速率（Pn）是反映植株叶片光合强度的最主要指标[16]，可以从一个侧面反映植株的生长活性。由图1所示，正常生长温度下，白叶1号和龙井43的净光合速率分别为4.50 μmol·m-2·s-1和5.65 μmol·m-2·s-1，白叶1号的净光合速率显著低于龙井43，仅为龙井43净光合速率的79.6%。但是低温胁迫处理24 h以后，龙井43的净光合速率为1.82 μmol·m-2·s-1，下降至常温水平的32.2%，而白叶1号的净光合速率为2.56 μmol·m-2·s-1，为常温水平的56.90%。低温胁迫后，白叶1号的净光合速率反而比龙井43高出40.7%。

注：图中不同字母代表不同处理间差异显著，P<0.05，下同。

2.2 低温对龙井43和白叶1号Fv/Fm的影响

叶绿素荧光被称为“光合作用的探针”，几乎所有光合作用过程的变化都可以通过叶绿素荧光反映出来，其中暗适应下PSⅡ的最大光化学量子产量Fv/Fm是植物对外界响应的重要参数[17]。图2-A为茶树叶片Fv/Fm的荧光成像，标尺上不同颜色对应着不同的数值，茶树叶片颜色的变化即反映着其Fv/Fm数值的变化，根据荧光成像结果的数字化分析获得图2-B。我们发现，正常温度下生长的龙井43与白叶1号的最大光化学量子产量Fv/Fm没有显著差异，分别为0.78、0.77。低温处理24 h后，龙井43叶片的Fv/Fm迅速降低至0.49，而白叶1号的Fv/Fm为0.66，与常温相比也有所下降，但比龙井43高约34.7%。以上结果说明，低温对白叶1号造成的光抑制程度要低于龙井43。

2.3 低温对龙井43和白叶1号Vcmax和Jmax的影响

植物叶片的Vcmax反映卡尔文循环中由1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）催化的最大羧化反应效率，Jmax是指在光合循环中1,5-二磷酸核酮糖（RuBP）产物的最大再生速率[18]。Rubisco是光合作用中重要的酶系统[19]，研究发现，常温环境下龙井43的Vcmax为23.6 μmol·m-2·s-1，白叶1号的Vcmax为18.1 μmol·m-2·s-1，即白叶1号叶片中Rubisco最大羧化速率约为龙井43的76.7%。但低温处理后，白叶1号的Vcmax却显著高于龙井43，二者分别为13.9 μmol·m-2·s-1和10.4 μmol·m-2·s-1（图3-A）。分析RuBP最大再生速率发现，不论是常温还是低温处理，白叶1号与龙井43的Jmax均没有显著差异（图3-B）。

2.4 低温对龙井43和白叶1号叶片中H2O2含量的影响

当植物受高温、低温、机械损伤及病原菌等胁迫后，组织内活性氧（ROS，Reactive oxygen species）产生和清除之间的平衡会受到干扰，导致ROS水平急速上升[20]，从而造成植物的氧化胁迫。过氧化氢（H2O2）是一类重要的ROS，通过DAB染色结果发现，常温环境下，白叶1号与龙井43叶片中的H2O2含量没有显著差异，但经低温处理后，龙井43叶片沿叶脉出现了大面积的黄褐色H2O2聚集区域，而白叶1号叶片只呈现淡黄色（图4）。这说明低温对龙井43造成的氧化胁迫程度要强于白叶1号。

图4 低温对龙井43和白叶1号叶片H2O2含量的影响

2.5 低温对龙井43和白叶1号抗氧化酶系统的影响

H2O2等活性氧是植物细胞各种代谢途径产生的副产物，在正常条件下会被特定组织的抗氧化防御机制清除[21]，主要包括抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化物酶（POD）等。试验结果（图5）表明，正常温度下白叶1号叶片中的APX、POD活性都显著高于对照龙井43，分别提高了34.1%、38.1%（图5-A、5-D）。经过低温处理24 h后，白叶1号叶片中APX、SOD、POD（图5-A、5-C、5-D）的活性均显著高于龙井43，三者分别提高38.9%、23.3%及33.3%。这说明，无论在常温条件下还是在低温胁迫后，白叶1号都具有较强的抗氧化能力。

3 讨论

根据以上实验结果，我们可以看到常温（25℃）条件下，返白期白叶1号反映植物光合能力的净光合速率（Pn）和最大羧化反应效率（Vcmax）都只有龙井43的70%~80%，而APX、POD等抗氧化酶活力都比龙井43高30%以上，表明白叶1号返白期的光合能力不如龙井43，但其抗氧化系统的修复能力却比龙井43强。在受到低温胁迫以后，反映白叶1号光合能力的各项参数指标反而高于龙井43，表明白叶1号在低温胁迫中受到的损伤程度要低于龙井43。

体验性营销包括先经历过——获得娱乐的体验——表达的欲望——传递了愉悦的基本流程。其中情绪和情感是研究的重点。

白化是植物叶色突变体的常见类型之一，其最典型的特征是叶绿体不能正常发育[22]。在白叶1号新梢返白期间，其叶绿体结构退化，片层结构破坏，叶绿素合成受抑制，从而导致叶绿素含量降低，没有完整的色素蛋白复合体[23-24]。李素芳等[25]研究发现，白叶1号叶片中的RuBP羧化酶大小亚基含量和活性在返白期间也会降低。叶片的色素蛋白复合体是植物捕获光能，并把能量迅速传至光化学反应中心，启动光合作用的一类蛋白复合体；RuBP羧化酶则是光合作用C3反应中重要的羧化酶，因此二者含量及活性的下降直接抑制了白叶1号在正常温度下的净光合速率（图1、图3-A）。Deng[26]研究叶色突变植物——金边龙舌兰发现，其叶片白化区域的H2O2含量及SOD、CAT、APX的活性都显著低于绿色正常区域；玉米叶片底部含叶绿素少的叶片中，其SOD、POD及CAT的含量却显著高于上部绿色叶片[27]，说明植物叶片抗氧化酶活性与叶绿素含量存在紧密的联系。我们的研究发现，常温环境下返白阶段的白叶1号APX和POD的活性同样高于龙井43品种（图5-A、5-D）。植物的抗氧化酶系统是维持植物组织内部ROS平衡，保护其在低温、高温、干旱、盐害、重金属等逆境胁迫下细胞结构和功能免受伤害的重要防御机制[28]，抗氧化酶活性的高低通常作为植物非生物胁迫抗性强弱的重要评判指标。比较低温条件下的白叶1号和龙井43的抗氧化酶活性发现，白叶1号叶片中APX、SOD及POD酶活都显著高于龙井43（图5-A、5-C、5-D），继而有效减少低温条件下叶片中H2O2的累积（图4），降低H2O2对细胞膜系统、叶绿体超微结构[29]及Rubisco分子结构的损伤与破坏[30]。因此，返白阶段的白叶1号与龙井43相比，其光合作用受低温抑制较弱，经低温处理24 h后，仍具有较高的净光合速率（图1）、最大光化学量子产量（图2）和Rubisco羧化速率（图3-A）。因此试验得出初步结论：返白阶段的白叶1号因具有较高活性的抗氧化酶系统，而使其低温抗性明显高于龙井43。

值得注意的是，常温下返白期白叶1号具有高活性的抗氧化酶，但叶片中并没有明显的H2O2积累。此时，H2O2是否作为植物体内非常重要的次级信号分子[31]，参与白叶1号的返白现象或者其代谢和品质调控也是值得深入研究的科学问题。

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Analysis of the Cold Resistance of Baiye 1

ZHANG Lan1, LI Xin1, WEI Jipeng1,2, LI Zhixin1,2, SHEN Chen1,2, YAN Peng1, ZHANG Liping1, HAN Wenyan1*

1. Tea Research Insititute, Chinese Academy of Agricultural Science, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

The cold resistance was compared in two cultivars, the albino Baiye 1 (cv.) during albinism period and Longjing 43 (cv.) in Zhejiang province. The results showed that the net photosynthesis rate (Pn) and maximum carboxylation rate of Rubisco (Vcmax) in Baiye 1 during the albinism period were only 70%-80% of those in Longjing 43, but the activities of antioxidant enzymes APX and POD were both 30% higher than those in Longjing 43 under normal temperature. However, when they were treated under 2℃ condition for 24 h, various parameters related to photosynthesis were higher in Baiye 1 than Longjing 43. The activities of APX, POD and SOD were also 38.9%, 33.3% and 23.3% higher in Baiye 1. All the results indicated that the albinism phenomenon of Baiye 1 may lead to the improvement of antioxidant system, which would effectively reduce the H2O2accumulation in tea leaves and alleviate oxidative damage and photosynthetic inhibition during cold stress. Therefore, Baiye 1 during albinism period may have a better cold resistance than Longjing 43.

Baiye 1, albinism, cold stress, antioxidant enzymes

S571.1；P423

A

1000-369X（2017）01-071-07

2016-08-01

2016-10-17

中国农业科学院科技创新工程资助

张兰，女，硕士，研究实习员，主要从事茶树栽培与生理生化研究。