不同脂肪酸组成的油脂对LPS诱导的小鼠肠道炎症的影响

赵 晓，张 永，张新胜，徐 庆，于晓明，李惠子，杨雪艳，刘英华*，薛长勇*

(1解放军总医院营养科，北京 100853；2火箭军总医院营养科，北京 100853)

不同脂肪酸组成的油脂对LPS诱导的小鼠肠道炎症的影响

赵 晓1，张 永1，张新胜1，徐 庆1，于晓明1，李惠子2，杨雪艳1，刘英华1*，薛长勇1*

(1解放军总医院营养科，北京 100853；2火箭军总医院营养科，北京 100853)

目的：比较不同脂肪酸组成的油脂对LPS诱导的小鼠肠道急性炎症的影响，为重症肠道感染提供肠内营养的数据参考。方法：取12w龄雄性C57BL/6J小鼠40只，腹腔注射LPS(3.5mg/kg)24h后，测量空腹体重，随机分为5组：玉米油组(ω-6脂肪酸)、橄榄油组(ω-9脂肪酸)、紫苏油组(ω-3脂肪酸)、中长链油组(中链脂肪酸)、LPS损伤组(灌胃葡萄糖)。根据组别灌胃小鼠，7d后取小鼠腹主动脉血及小肠组织，测定细胞因子水平和TLR4信号通路中相关分子的mRNA表达，并进行小肠组织病理切片观察。研究期间每日测量小鼠体重。结果：研究结束时，各组小鼠体重均升高，以橄榄油组和紫苏油组最高，且与LPS损伤组和玉米油组比较均有显著性差异(P<0.05)；血和小肠中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及小肠TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表达以中长链油组最低，与LPS损伤组和玉米油组比较均有显著性差异(P<0.05)，而与橄榄油组和紫苏油组无显著性差异(P>0.05)。小肠组织病理切片结果显示：各组小鼠小肠粘膜均有不同程度的损伤，以LPS损伤组损伤最明显，玉米油组次之，橄榄油组处于中等水平，中长链油组与紫苏油组损伤较轻。结论：中链脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸来源的油脂对LPS诱导的肠道炎症的修复作用均优于ω-6脂肪酸来源的油脂和葡萄糖，机制可能为抑制肠道TLR4信号传导途径相关因子表达，减少促炎细胞因子释放。

脂肪酸；LPS；肠粘膜损伤；炎症反应

重症感染是全身性感染导致的以器官功能损害为特征的临床综合征[1]，其中，肠道炎症是重症感染的主要表现。当机体遭受严重创伤、休克、肠缺血以及严重感染等重症应激状态时，大量肠道细菌移位导致肠上皮细胞损伤，并激活一系列免疫反应，导致炎症介质大量产生和释放，引发肠道炎症甚至全身炎症反应。适时和恰当地应用肠内营养不仅能有效改善患者的营养状况，还可以有效改善肠粘膜损伤[2-3]，其可能通过加速缓解肠道炎症来实现。本课题组前期研究结果显示中链脂肪酸和ω-3脂肪酸可以有效降低肥胖小鼠小肠组织炎症因子水平及Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)传导通路中相关蛋白的表达。但针对肠道感染状态下不同脂肪酸来源的油脂是否可以通过TLR4传导通路减轻肠道炎症反应并改善肠功能尚有待进一步研究。此外，有关重症研究多集中在肠外营养。故本次研究拟通过观察不同脂肪酸组成的油脂对肠道炎症的影响，为重症肠道感染患者实施肠内营养治疗时选择何种脂肪来源的肠内营养制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物模型的建立及分组

SPF级健康12w龄雄性C57BL/6J小鼠，由中国医学科学院实验动物研究所提供，生产许可证号为SCXK(京)2014-0004，使用许可证号为SYXK(军)2012-0010。小鼠由普通饲料适应性喂养1w后，按5、4.5、4、3.5、3、2.5mg/kg的剂量腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)。每日测量体重，选择第2d体重下降>5%且3d内不死亡的最低剂量作为实验研究用剂量，为3.5mg/kg。另购买40只12w龄雄性C57BL/6J小鼠，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后，测量空腹体重，随机分为5组，每组8只小鼠：玉米油组(ω-6脂肪酸)、橄榄油组(ω-9脂肪酸)、紫苏油组(ω-3脂肪酸)、中长链油组(中链脂肪酸)、LPS损伤组。5组小鼠分别灌胃玉米油(100μL/d)、橄榄油(100μL/d)、紫苏油(100μL/d)、中长链油(100μL/d)、葡萄糖(200μL/d、浓度为1g/mL)，连续灌胃7d，研究期间仍以普通饲料继续喂养。

1.2 主要试剂及引物

紫苏油，由上海益寿金生物制品有限公司提供；中长链油，由日清奥利友(中国)投资有限公司提供；玉米油、橄榄油，分别购自中粮品牌和欧丽薇兰品牌；LPS(Escherichia coli 026：B6)，购自美国Sigma公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒(Cat.No.23225)，购自美国Pierce公司；肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、ELISA试剂盒(Cat.No.MCYTOMAG-70K-PMX)，购自德国Merck公司；核糖核酸(RNA)提取试剂盒、逆转录-PCR(RT-PCR)试剂盒，购自美国Promega 公司；TLR4抗体(ab13556)、髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)抗体(ab2064)、TNF-α抗体(ab6671)，均购自美国Abcam公司；Trizol、M-MLV 逆转录酶，购自美国Invitrogen 公司；其他试剂为进口分析纯试剂。引物合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司提供，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3 检测指标和方法

1.3.1 动物体重及血、小肠组织的处理 研究期间每日固定时间点测量小鼠体质量并记录。各组灌胃7d后处死小鼠，经腹主动脉采集血样，3 000～4 000 r/min离心，取血清储存于-80℃，待ELISA试剂盒检测相关炎症因子水平。分离出全部小肠组织，共分3部分：第一部分立即放于液氮中备检mRNA；第二部分用0.9% 氯化钠注射液按10% 浓度制成匀浆，700 r/min 离心15 min，取上清液，冻存于液氮中，待ELISA试剂盒检测炎症因子水平；第三部分小肠组织用蒸馏水漂洗后，浸泡于多聚甲醛中进行固定，待进行病理切片观察。

1.3.2 血和小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平测定 取冻存的血清和小肠组织上清液，运用BCA法测定小肠组织蛋白浓度，再根据ELISA 检测试剂盒说明分别检测血清和小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.3 小肠组织中TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表达测定 每个小肠组织样本约100mg，首先按Trizol 试剂的操作说明进行RNA提取，以总RNA 3 μg为逆转录反应模板，采用随机引物，按照反转录试剂盒的操作步骤说明在普通PCR 仪上进行逆转录，再以2 μL逆转录反应产物为模板，按照荧光实时定量PCR (real-time RT-PCR)试剂盒说明书，冰上配置50 μL的PCR 反应体系，进行小肠组织中mRNA表达测定。实时定量PCR 扩增条件为：95 ℃预变性120 s，95 ℃变性20 s，59 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，45 个循环。目的基因表达采用Ct (threshold cycle，Ct)值法，以各样本基因的Ct值与其相应内参照β-actin基因的Ct值之差(ΔCt)来表示，表示方法为2- ΔΔ Ct，即为2Δ Ct(actin)-Δ Ct(target gene)。

1.3.4 小肠组织病理标本处理及染色 将固定的小肠组织进行常规石蜡包埋、切片，切片厚度为2 μm，行HE染色后于光镜下观察组织病理学改变。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 小鼠模型建立、分组及体重变化情况

实验开始时小鼠体重为28.44±1.01g，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后体重为26.43±1.45g，体重下降百分比为7.1%，存活率100%。按空腹体重随机分为5组，经不同油脂灌胃干预1w后，各组小鼠体重均升高，橄榄油、紫苏油组和中长链油组体重增长显著高于LPS损伤组和玉米油组(P<0.05)，其中，紫苏油组和橄榄油组体重增长值较高，但与中长链油组差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 小鼠体质量变化趋势注：*与玉米油组比较，P<0.05；#与LPS损伤组比较，P<0.05

2.2 不同脂肪酸组成的油脂对小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

橄榄油组、紫苏油组和中长链油组小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著低于玉米油组、LPS损伤组(P<0.05)，其中，以中长链油组因子水平最低(表2)。

表2 小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*与玉米油组比较，P<0.05；#与LPS损伤组比较，P<0.05

2.3 不同脂肪酸组成的油脂对小鼠小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-α mRNA表达的影响

橄榄油组、紫苏油组和中长链油组小鼠小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-αmRNA表达均显著低于玉米油组、LPS损伤组(P<0.05)，其中，以中长链油组因子水平最低(表3、图2)。

表3 小鼠小肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*与玉米油组比较，P<0.05；#与LPS损伤组比较，P<0.05

图2 小鼠小肠组织中TLR4、MyD88、TNF-α mRNA表达注：*与玉米油组比较，P<0.05；#与LPS损伤组比较，P<0.05

2.4 不同脂肪酸来源油脂对小鼠小肠病理切片影响

各组小鼠小肠粘膜均有不同程度的损伤，以LPS损伤组损伤最明显，玉米油组次之，橄榄油组小肠粘膜损伤处于中等水平，中长链油组与紫苏油组未见明显异常(图3)。

3 讨论

肠道作为人体最大的消化器官和免疫器官，其正常粘膜屏障作用的维持有赖于肠粘膜连续性的完整和正常的肠粘膜支持系统，众多应激因素和感染的存在可能使两者发生异常，从而导致肠粘膜屏障的损伤，促发系统性炎症反应。因此，改善与维持肠粘膜屏障功能是多种疾病尤其是重症感染治疗中的重要保证。多项研究结果证明，肠内营养可有效改善肠粘膜屏障功能，改善肠粘膜损伤[4]。肠内营养不但能直接供给营养，还具有较肠外营养更优越的地方，如促使肠蠕动功能的恢复、加速门静脉系统的血液循环、促进胃肠道激素的分泌等。本次研究结果显示，LPS损伤建立小鼠肠道感染模型后，无论是灌胃葡萄糖还是灌胃不同脂肪酸组成的油脂，小鼠体重都有不同程度的升高，说明肠内营养对重症感染的恢复具有一定的促进作用。

机体在重症应激状态下，会出现细菌移位和内毒素血症，进一步加剧肠上皮细胞的损伤并刺激肠粘膜免疫细胞，激活细胞内一系列的免疫反应，导致大量炎症介质如TNF-α、IL-6等的产生和释放。TLR4在先天性免疫反应的炎症信号通路中具有重要作用，其通过识别病原相关分子模式的特有抗原成分而进行信号识别和传导。革兰氏阴性细菌的细胞壁成分脂多糖LPS是TLR4最重要的配体[5]，通过结合CD14、LBP、TLR4形成受体复合物，与MyD88结合触发下游信号级联反应，最终激活NF-κB，加剧促炎因子和COX2的释放[6]。在这样的背景下，本次研究旨在针对肠道感染状态下，不同脂肪酸来源的油脂是否可以通过TLR4传导通路减轻炎症反应以改善肠功能。研究结果显示，中链脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸来源的油脂的干预可以在短期内有效降低小肠炎症水平，改善肠粘膜损伤，并抑制TLR4信号通路相关蛋白的表达，说明这3种油脂干预对LPS诱导的体重减轻和炎症反应的有益作用要优于葡萄糖和ω-6脂肪酸来源的油脂，机制可能与TLR4信号通路的抑制有关。

图3 不同脂肪酸来源的油脂组小肠病理切片(×100)

我们课题组前期进行过ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)干预可以改善LPS诱导的小鼠体重降低的研究[7]；同时进行过MCFA可以有效降低肥胖小鼠的小肠炎症水平的实验。以往也有研究结果显示，ω-9单不饱和脂肪酸可以有效减少机体的氧化应激损伤和炎症反应[8]。为此，本实验将三种脂肪酸来源的油脂与常用的ω-6脂肪酸来源的油脂及葡萄糖进行对比，结果显示：中链脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸来源的油脂对LPS诱导的肠道炎症的修复作用较好，以MCFA效果最佳，提示其作为肠内营养制剂的组成成分将有助于改善重症肠道感染患者疾病状况。但其以何种比例进行肠内营养可以达到更好的效果还有待进一步研究。◇

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(责任编辑 李婷婷)

Effects of Oil Composed of Different Fatty Acids on Intestinal Inflammation Induced by LPS in C57BL/6J Mice

ZHAO Xiao1，ZHANG Yong1，ZHANG Xin-sheng1，XU Qing1，YU Xiao-ming1，LI Hui-zi2，YANG Xue-yan1，LIU Ying-hua1，XUE Chang-yong1

(1Department of Nutrition，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2Department of Nutrition，The Rockets Army General Hospital of PLA，Beijing 100853，China)

fatty acid；LPS；intestinal mucosal injury；inflammation

国家自然科学基金(项目编号：81541067、81202203)；解放军总医院科技创新苗圃基金(项目编号：15KMM45)。

赵晓(1991— )，女，在读硕士，研究方向：临床营养与脂代谢。

*共同通信作者：刘英华(1977— )，女，博士，副主任医师，副教授，研究方向：临床营养；薛长勇(1962— )，男，硕士，主任医师，教授，研究方向：临床营养与脂代谢。