高效液相色谱法测定蔬菜中β-胡萝卜素的不确定度评定

王晓婧，曹梦锦，张雪松，王国栋，王 竹

(中国疾病预防控制中心营养与健康所/国家卫生和计划生育委员会微量元素重点实验室，北京 100050)

高效液相色谱法测定蔬菜中β-胡萝卜素的不确定度评定

王晓婧，曹梦锦，张雪松，王国栋，王 竹

(中国疾病预防控制中心营养与健康所/国家卫生和计划生育委员会微量元素重点实验室，北京 100050)

建立高效液相色谱法测定蔬菜中β-胡萝卜素的不确定度评定数学模型，计算β-胡萝卜素测量结果的不确定度。胡萝卜和菠菜中β-胡萝卜素的扩展不确定分别为0.684和0.444 mg/100g(k=2、P=95%)。影响β-胡萝卜素HPLC法测定的不确定度来源主要是样品均匀性、前处理过程及HPLC仪器定量重复性，不确定度评定有利于完善测定结果的准确性。

不确定度；β-胡萝卜素；蔬菜；高效液相色谱法

β-胡萝卜素由于其如显著的维生素A原活性、抗氧化、防癌、利于心血管健康等而备受关注[1-3]。天然摄入的β-胡萝卜素主要来源于植物性食物，其含量测定方法中高效液相色谱法(HPLC)因其准确度高、操作相对简便，可将胡萝卜素各单体物质分离并分别予以定性和定量的优点而成为β-胡萝卜素分析的主流方法[4-7]。本研究组在《食品安全国家标准 食品中β-胡萝卜素的测定》的标准整合过程中，为提高提取效率、改善色谱分离效果及增进β-胡萝卜素结果的科学表达，提出了以下几点改进之处：一是前处理过程中增加了低温醇提步骤，有效提高胡萝卜素的提取效率；二是在HPLC测定中采用C30Carotenoid色谱柱，将α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及其顺反异构体进行分离，从而实现分别计量；三是按照AOAC方法将β-胡萝卜素的各顺反式异构体分别定性定量并综合评定β-胡萝卜素的含量[9]，以避免造成结果的低估或偏估。本试验根据JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[10]，对蔬菜中β-胡萝卜素含量测定的不确定度进行了测量和评定，以期为评定测量结果提供参考。

1 材料与方法

1.1 测量所需材料与步骤

1.1.1 仪器与试剂 仪器与耗材：高效液相色谱仪(Waters 2 695，美国Waters公司)；紫外检测器(Waters 2 487，美国Waters公司)；YMC Carotenoid C30色谱柱(3μm，4.6×150 mm)；紫外分光光度计(722G型，上海精科)；旋转蒸发仪(RE-2010型，巩义市京华仪器有限责任公司)；恒温振荡水浴锅(SHZ-88，太仓市实验设备厂)；分析天平(Mettler MS204S，瑞士梅特勒托利多公司)；所有玻璃器皿均为A级。

标准品与试剂：β-胡萝卜素(CAS号：7235-40-7，纯度>95%)，购于Sigma公司；甲醇为色谱级 (Fisher Scientific公司，批号152469)；乙腈为色谱级(Fisher Scientific公司，批号150942)；甲基叔丁基醚为色谱纯(Fisher Scientific公司，批号147314)；二氯甲烷为色谱纯(Fisher Scientific公司，批号148424)；正己烷为色谱纯(Fisher Scientific公司，批号152474)；试验用水为超纯水(电阻率≥18.2MΩ·cm)。无水乙醇为优级纯(北京化工厂，批号20150618)；石油醚(沸程30～60℃，北京化工厂，批号20151012)；氢氧化钾(西陇化工股份有限公司，批号120716)；无水硫酸钠(西陇化工股份有限公司，批号140913)；均为分析纯。

1.1.2 测量步骤 (1)标准溶液的配制及标定：将β-胡萝卜素标准品用二氯甲烷溶解，配制成浓度约500 μg/mL储备液，分装保存在-20℃冰箱内；试验当日，取β-胡萝卜素储备液100 mL，加正己烷稀释并定容至10 mL。以正己烷为空白，入射光波长为450 nm测定其吸光度值，平行测定3次，取均值，按式(1)计算标准液浓度。

(1)

式(1)中：CR为β-胡萝卜素标准储备液的标定浓度；A为β-胡萝卜素的吸光度值；E为以正己烷为溶剂时β-胡萝卜素的比吸光系数(0.262 0)；V2为定容体积(mL)；V1为移取标准储备液的体积(mL)。

(2)全反式β-胡萝卜素响应因子(RF)的测定：将β-胡萝卜素储备液稀释为浓度约3 μg/mL的标准使用液，注入HPLC仪中，根据保留时间测定-胡萝卜素各异构体峰面积，平行测定6次。全反式β-胡萝卜素的色谱纯度(CP)和响应因子(RF)分别按式(2)和式(3)计算：

(2)

(3)

式(2)和(3)中：CP为全反式β-胡萝卜素的色谱纯度；Rsum为标准使用液中β-胡萝卜素各异构体(包括全反式β-胡萝卜素、9-顺式β-胡萝卜素、13-顺式β-胡萝卜素、15-顺式β-胡萝卜素及其他顺式结构)的峰面积总和；Rall-E为标准使用液中全反式β-胡萝卜素的峰面积；R9Z为标准使用液中9-顺式β-胡萝卜素的峰面积；R13Z为标准使用液中13-顺式β-胡萝卜素的峰面积；R15Z为标准使用液中15-顺式β-胡萝卜素的峰面积；RxZ为标准使用液中其他顺式β-胡萝卜素的峰面积；Cr为β-胡萝卜素标准使用液的浓度。

(3)样品前处理：取匀质化的蔬菜样品0.5～1 g(精确至0.001g)于100mL锥形瓶中，加入0.5 g抗坏血酸，30 mL无水乙醇，于60 ℃水浴振荡30 min，后加入10 mL饱和氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃恒温振荡水浴箱中，皂化30 min。取出，静置，冷却到室温。将皂化液转入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡10 min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入250 mL蒸发瓶中，于旋转蒸发仪上40℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，用移液管准确加入5.0 mL二氯甲烷，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45 μm膜过滤后供液相色谱分析用。

(4)色谱条件：YMC Carotenoid C30色谱柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流速1 mL/min；柱温30℃；检测波长450 nm；流动相为A(甲醇∶乙腈∶水73.5∶24.5∶2)、B(甲基叔丁基醚)，洗脱程序：100%～59% A线性变换(0～15 min)，59%～20% A线性变换(15～19 min)，20%～0% A线性变换(19～20 min)。根据保留时间和相对位置定性，通过计算各异构体的峰面积来定量。

1.2 测量数学模型的建立

本试验中β-胡萝卜素的计算公式为式(4)：

(4)

式(4)中：X为待测样品中β-胡萝卜素的含量(μg/100g)；S为待测液中β-胡萝卜素各异构体经校正后的色谱峰总面积；V为试样液定容体积(mL)；RF为全反式β-胡萝卜素响应因子(计算方法见1.1.2)；m为试样质量(g)；其中：S=Sall-E+S9Z+S13Z×1.2+S15Z×1.4+SxZ，Sall-E为待测液中全反式β-胡萝卜素峰面积、S9Z为待测液中9-顺式-β-胡萝卜素的峰面积、S13Z为待测液中13-顺式-β-胡萝卜素的峰面积、S15Z为待测液中15-顺式-β-胡萝卜素的峰面积，SxZ为待测液中其他顺式β-胡萝卜素的峰面积，1.2和1.4分别为13-顺式-β-胡萝卜素和15-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子。

测量结果的不确定性除受到公式中S、V、RF和m的影响外，样品均匀性和前处理过程的一致性都会对检测结果产生影响，考虑其影响量，公式中需加入校正因子frep，式(4)则转化为式(5)：

(5)

(6)

1.3 不确定度来源分析

蔬菜中β-胡萝卜素测量结果的不确定度来源主要包括：标准储备液的标定、标准溶液和样品溶液稀释定容过程中的玻璃量器、样品的天平称量、HPLC定量、样品均匀性和前处理引入的不确定度等方面。

1.4 不确定度分量的评定方法

1.4.1 A类评定 由观测列统计分布所作的不确定度评定，即对被测量进行独立重复观测，A类评定的标准不确定度以所得到的一系列测得值的试验标准偏差表示。此类评定包括了测量过程中的各种随机效应，包括样品的均匀性和代表性、环境条件、仪器状态、人员操作及前处理等导致的不确定度。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素色谱峰总面积(S)的相对标准不确定度

2.2 全反式β-胡萝卜素响应因子(RF)测定的相对标准不确定度

本试验采用紫外-可见分光光度计(722G型)进行标定，其检定证书显示其相对扩展不确定度为0.5%，k=2，则相对标准不确定度为0.005/2=0.002 5。

2.2.3 HPLC测定引入的相对标准不确定度urel(LC) 计算方法见2.1。

2.3 样品称重(m)的相对标准不确定度

样品称重引入的不确定度由天平的最大允许误差构成。称重使用Mettler MS204S电子天平，其检定证书给出称量砝码重量为10 mg时的扩展不确定度为0.002 mg，k=2，由天平称量产生的相对标准不确定度为0.002/2/10=0.000 1。

2.4 样品定容体积(V)的相对标准不确定度

2.5 样品均匀性和样品前处理过程中(frep)引入的不确定度

表1 测量重复性结果 单位：mg/100g

表2 加标回收率实验及前处理引入的不确定评定

2.6 合成标准不确定度 urel(X)

将表3中各种相对标准不确定度按照式(6)合成，可以得到两种蔬菜中β-胡萝卜素含量测量结果的合成相对标准不确定度及合成标准不确定度。

表3 两种蔬菜样品中β-胡萝卜素不确定度来源及合成标准不确定度

2.7 扩展不确定度及测量结果

依据标准JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[10]，对大多数测量不确定评估，取置信水平95%，k=2，则扩展不确定度为 U(X)= 2×uc(X) 。测得胡萝卜中β-胡萝卜素的含量及不确定度为5.68 mg/100g (U =0.684 mg/100g，k=2)，菠菜中β-胡萝卜素的含量及不确定度为3.00 mg/100g (U =0.444 mg/100g，k=2)。

3 讨论

本试验以富含β-胡萝卜素的胡萝卜和菠菜为代表，评估了HPLC法测量β-胡萝卜素含量的不确定度，得出影响测量结果的不确定度的主要来源为HPLC仪器测量重复性、样品测量重复性及前处理过程。前者引入的不确定度由方法本身决定，主要体现在全反式β-胡萝卜素的响应因子RF的测定和样品结果测量过程中均需要计入4种顺反式异构体的峰面积。因此今后在使用HPLC法测量β-胡萝卜素含量时，根据不确定度分量加强准确测量，应注意以下几点：(1)减少前处理及其他随机过程引入的系统误差，注意取样的均匀性、代表性，保证操作规范和一致，平行测量；(2)定期对仪器进行期间核查和维护保养，以保证仪器的稳定性；(3)将标准储备液制备得到标准使用液过程中，经历了两次稀释步骤，增加了不确定度来源，可考虑将制备得的标准使用液再次标定，将标定所得的标准使用液浓度Cr代入计算，减少测定结果的不确定度。从本试验研究结果来看，不确定度评价不仅可用于评估测量方法的可靠性和测量结果的可信程度，而且可以通过分析测量过程的主要误差来源完善方法的准确性。◇

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(责任编辑 刘宏)

Uncertainty Evaluation on Determination ofβ-carotene in Vegetables by HPLC

WANG Xiao-jing，CAO Meng-jin，ZHANG Xue-song，WANG Guo-dong，WANG Zhu

(National Institute for Nutrition and health，CDC/Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China，Beijing 100050，China)

A mathematical model was established for determiningβ-carotene in vegetables by HPLC and the measurement uncertainty was evaluated.The expand uncertainties ofβ-carotene were 0.684 mg/100g (k=2，P=95%，for carrot)and 0.444 mg/100g (k=2，P=95%，for spinach)，respectively.The uncertainty from sample uniformity，pretreatment and HPLC instrument were the main sources of uncertainty and uncertainty evaluation was helpful to promote the accuracy of measurement.

uncertainty；β-carotene；vegetable；high performance liquid chromatography (HPLC)

“十二五”国家科技支撑项目“功能食品资源优化和评价共性关键技术研究”(项目编号：2012BAD33B01)；卫计委标准司“国家食品安全标准 食品中β-胡萝卜素的测定方法研究”。

王晓婧(1985— )，女，博士，助理研究员，研究方向：食物营养。

王竹(1970— )，女，博士，研究员，研究方向：食物营养。