自发性高血压大鼠左心室心肌应变与心肌纤维化程度的相关性

马新欣，张跃力，王 曼，郑东燕，薛晓培，朱梦若，江文君

(上海交通大学附属第六人民医院超声医学科 上海医学超声研究所，上海 200233)

自发性高血压大鼠左心室心肌应变与心肌纤维化程度的相关性

马新欣，张跃力*，王 曼，郑东燕，薛晓培，朱梦若，江文君

(上海交通大学附属第六人民医院超声医学科 上海医学超声研究所，上海 200233)

目的 探讨自发性高血压大鼠(SHR)左心室心肌应变与心肌纤维化程度的关系。方法 选取10周龄雄性SHR及Wistar-Kyoto大鼠(WKY)各15只，均随机平均分为3个亚组。12周后每2周行常规超声及二维斑点追踪显像(2DSTE)，于左心室长轴和乳头肌水平短轴切面测量左心室整体纵向应变(GLS)、径向应变(GRS)及周向应变(GCS)峰值。分别于16、20、24周将SHR和WKY各取1个亚组处死，行心脏离体固定、Masson染色，观察心内膜下和心外膜下层心肌胶原容积分数(CVF)、血管周围胶原面积与管腔面积比率(PVCA/LA)。结果 与同周龄WKY相比，SHR的GLS自16周、GRS自18周、GCS自20周显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。SHR的GLS与心内膜下CVF呈正相关(r=0.65，P<0.05)；GLS、GCS与PVCA/LA呈正相关(r=0.65、0.63，P均<0.05)，GRS与PVCA/LA呈负相关 (r=-0.59，P<0.05)。结论 2DSTE技术可无创评价大鼠心肌形变，其与心肌纤维化程度具有良好的相关性。

超声心动描记术；高血压；斑点追踪应变显像；应变；心肌纤维化

高血压易致脑卒中、缺血性心脏病及心衰等严重并发症，是心血管疾病的主要危险因素[1]。高血压可导致心脏结构与功能改变，且二者间密切相关。心肌纤维化是高血压性心脏病的病理基础，易致心肌僵硬度增加、左心室舒张功能减退、心律失常甚至心衰[2]。对心肌纤维化程度的评价，有助于指导临床治疗和预测疾病转归。二维斑点追踪应变显像(two-dimensional speckle tracking echocardiography, 2DSTE)能定量分析心脏整体和局部心肌的形变能力[3-4]。本研究探讨采用2DSTE技术获取的左心室心肌应变参数在反映心肌纤维化程度方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1实验动物 10周龄雄性自发性高血压大鼠(spontaneously hypertension rats， SHR)15只，随机平均分为3个亚组，采用2%氯化钠盐饲。同周龄京都Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats， WKY)15只作为对照组，随机平均分为3个亚组，采用2%氯化钠盐饲。适应性喂养12周后，每隔2周测量大鼠血压、心率和体质量，并行超声心动图检查。

1.2仪器与方法 采用Philips iE33彩色多普勒超声诊断仪，12S高频探头；TomTec超声工作站，TomTec-Image Arena 4.0软件；Olympus BX51显微镜。

对大鼠采用戊巴比妥钠麻醉后左侧卧位固定，胸前备皮，同步记录胸导联心电图。调整超声仪器使帧频≥200帧/秒，获取胸骨旁左心室长轴切面(图1A、1B)和左心室乳头肌水平短轴切面，并连续采集1 s二维灰阶动态图像。于常规左心室长轴切面测量左心房内径(left atrial diameter, LAD)。将M型超声的取样线置于左心室乳头肌水平短轴切面获取M型曲线，测量左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、室间隔厚度(interventricular spetal thickness, IVST)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)，计算获得相对室壁厚度(relative wall thickness, RWT)和左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

1.3图像分析 将所存储的动态灰阶图像导入TomTec超声工作站进行脱机分析。于收缩末期停帧，手动勾画心内膜边界，生成ROI，观察所勾画边界曲线能否自动跟踪内膜，如不能实时跟踪则手动修正。软件可自动生成包含心室6个心肌节段的应变-时间曲线及各节段应变的平均曲线。分别于左心室胸骨旁长轴切面和乳头肌水平短轴切面的应变-时间平均曲线上，测量左心室心肌收缩期整体周向应变(global circumferential strain, GCS)、径向应变(global radial strain, GRS)和纵向应变(global longitudinal strain, GLS)峰值(图1)。

1.4大鼠心肌组织学分析 分别于16、20、24周超声检查后，将SHR和WKY各取1个亚组处死，离体心脏用10%缓冲甲醛固定液固定，取左心室游离壁中间段心肌进行病理切片和Masson染色，显微镜下观察以下指标：①心肌胶原容积分数(collagen volume fraction, CVF)，于20倍镜视野下每张切片随机选取5个视野进行拍照保存，用Imagepro-Plus 6.0软件调节保存图像的灰度以区分胶原与非胶原成分，CVF=心肌胶原面积/(心肌总面积-空白面积)×100%，以反映心肌间质中的心肌纤维化程度。以每张切片5个视野的平均值作为该标本的CVF，其中胶原面积不包括血管周围的胶原面积。②血管周围胶原面积/血管管腔面积(perivascular collagen area to luminal area ratio, PVCA/LA)×100%，随机选取5根小动脉的横断面拍照保存，采用上述方法，计算血管壁周围胶原面积与小动脉管腔面积的比值，取5根小动脉比值的平均值作为该标本的PVCA/LA，以此反映血管周围胶原纤维化程度。

1.5重复性检验 采用变异系数(coefficient of variance， CV)进行评价。随机选取10只大鼠，由观察者本人重复测量2次，获得观察者内CV，由另1名观察者重复测量1次，获得观察者间CV。

表1 两组大鼠二维及多普勒超声心动图参数比较(±s)

注：*：与WKY组比较，P<0.05

图1 SHR的2DSTE分析图像 A、B.于左心室长轴切面描记心内膜，软件自动生成整体纵向应变-时间平均曲线； C、D.于左心室乳头肌水平短轴切面描记心内膜，获得整体周向应变-时间平均曲线

2 结果

2.1一般资料和超声指标比较 SHR和WKY两组大鼠的体质量、心率和收缩压的比较见图2，同周龄WKY组的体质量大于SHR组；SHR组的收缩压高于同周龄WKY，且随着周龄增加逐渐上升，14～24周两组大鼠的体质量、收缩压差异均有统计学意义(P均<0.05)。两组大鼠的心率波动较大，但无明显统计学差异(P均>0.05)。

SHR和WKY两组大鼠常规二维超声心动图指标的比较见表1。22、24周时，SHR组的LAD较同周龄WKY组增大；24周时，SHR的LVIDd、IVST、LVPWT和RWT均高于同周龄WKY大鼠(P均<0.05)。

SHR和WKY两组大鼠的应变指标总体变化趋势见表2、图3。与同周龄WKY相比，SHR的GLS自16周、GRS自18周、GCS自20周显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)。两组大鼠的心内膜下和心外膜下CVF、PVCA/LA的比较见表3、图4。SHR组的CVF和PVCA/LA随着周龄逐渐增加，均高于同周龄WKY组 (P均<0.05)，且同周龄SHR组的心内膜下层心肌CVF均大于心外膜下层的CVF。

2.2相关性分析 SHR组的GLS与心内膜下心肌CVF呈正相关(r=0.65，P<0.05)，而GRS和GCS与心外膜下、心内膜下CVF均无显著相关性(P均>0.05)。GLS、GCS与PVCA/LA均呈正相关(r=0.65、0.63，P均<0.05)，GRS与PVCA/LA呈负相关(r=-0.59，P<0.05)。

2.3重复性检验 GLS的观察者内CV为(5.62±1.78)%，观察者间CV为(8.69±4.61)%；GCS的观察者内CV为(7.86±2.63)%，观察者间CV为(9.62±3.18)%；GRS的观察者内CV为(6.84±1.92)%，观察者间CV是(8.21±3.27)%。

3 讨论

2DSTE技术可用于定量分析心肌功能，包括心肌的纵向、径向、周向应变等。左心室心肌走向较为特殊[5-6]，心内膜下心肌呈纵行的右手螺旋形、心外膜下心肌为纵行的左手螺旋形，中层心肌纤维呈横向排列，左心室收缩过程中不同走行方向心肌可产生多维空间形变运动。

表2 两组大鼠应变参数比较(±s)

注：*：与WKY组比较，P<0.05

表3 两组大鼠病理组织学参数比较(%，±s)

注：*：与WKY组比较，P<0.05

与同周龄WKY相比，随着周龄增加，SHR的收缩压逐渐增高，IVST和LVPWT代偿性增厚，LAD、LVIDd于实验后期有轻度增大。这因为长期高血压引起心脏后负荷加重，导致左心室发生重构[7-8]。随着高血压进展，心肌微血管功能减退，心肌纤维化加重，心肌僵硬及心室舒张功能减退，最终可导致高血压性心衰[9]。

本研究结果显示，虽然SHR的LVEF与WKY相比差异无统计学意义，但应变所反映的心肌收缩功能已出现改变，表现为与同周龄的WKY相比，SHR的GLS、GCS、GRS下降明显，且GLS降低早于GCS、GRS。这表明左心室GLS能较GCS、GRS更为敏感、更为早期地识别异常心肌，是预测临床不良心血管事件的重要指标，与Martinez等[10-13]的研究结果相符。因为在SHR的高血压进程中，心内膜下层最易受心肌缺血等因素影响，最先出现胶原基质异常沉积，故心肌纵向形变能力最先出现下降，表现为保留LVEF的心肌舒张功能受限；随病程加重，心肌中层、心外膜下层胶原纤维均增多且排列紊乱，此时累及径向应变和周向应变，舒张功能不全发展为心肌收缩障碍[14]。

图2 各周龄SHR和WKY大鼠的体质量(A)、收缩压(B)及心率(C)变化情况 (*：与WKY比较，P<0.05)

本研究中SHR的GLS与心内膜下层CVF呈正相关，而GRS、GCS则与心外膜下、心内膜下CVF无明显的相关性，与Ishizu等[15]研究结果一致，可能与研究的周数较短有关。病理组织学分析发现，SHR的PVCA/LA与GLS、GCS、GRS均呈明显相关性，纤维胶原在SHR室壁小动脉旁异常积聚，导致血管结构重构，表现为血管壁增生、管腔变小，动脉弹性减弱，应变能力随之下降，进而可影响心肌细胞的血供。这些结果提示SHR左心室心肌收缩期的多维应变的下降与心肌纤维化的分布和程度相一致。

本研究的局限性：①样本量较少，研究周数较短；②由于未对大鼠心肌进行聚合酶链式反应检测，故未能从分子水平分析大鼠心肌纤维化程度；③仅观察了16周后大鼠心脏的心肌纤维化程度，未对16周之前的CVF与GLS进行分析比较；④体质量较大的大鼠，左心室长轴和短轴切面成像质量较好，但由于大鼠心率过快，影响组织多普勒测量的准确性，导致对心脏舒张功能的评价受限。

综上所述，基于2DSTE技术的应变成像能够反映自发性高血压大鼠左心室心肌纤维化程度，其中左心室心肌GLS最先受损，其能够较GCS和GRS更早期地用于评估心内膜下心肌纤维化程度。左心室应变指标的变化对研究高血压心脏病的发展进程、危险分层及预后有重要的指导价值。

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Relationship between left ventricular global strain and myocardial fibrosis in spontaneously hypertension rats

MAXinxin,ZHANGYueli*,WANGMan,ZHENGDongyan,XUEXiaopei,ZHUMengruo,JIANGWenjun

(DepartmentofUltrasound,SixthPeople'sHospitalAffiliatedShanghaiJiaoTongUniversity,ShanghaiInstituteofUltrasoundinMedicine,Shanghai200233,China)

Objective To investigate the relationship between left ventricular strain and myocardial fibrosis in spontaneously hypertension rats (SHR). Methods Totally 15 SHR and 15 Wistar-Kyoto rats(WKY) with 10 weeks old were observed， each group was randomly divided into 3 subgroups. Echocardiography and two-dimensional speckle tracing echocardiography (2DSTE) were performed every two week from 12 weeks. two-dimensional dynamics images were required from the left ventricular long axis view and papillary muscle short axis view, and then the left ventricular peak global longitudinal strain (GLS), radial strain (GRS) and circumferential strain (GCS) were measured. One subgroup of SHR and WKY rats were killed and hearts were isolated at 16, 20 and 24 weeks respectively. The myocardium were fixed and performed Masson staining to observe collagen volume fraction (CVF) in subendocardial and subepicardial myocardium, perivascular collagen area to luminal area ratio (PVCA/LA). Results Compared with WKY rats, global strain of SHR significantly decreased, GLS significantly decreased since 16 weeks, GRS decreased since 18 weeks and GCS decreased since 20 weeks (allP<0.05). GLS was positively correlated with subendocardial CVF (r=0.65,P<0.05). GLS and GCS were positively correlated with PVCA/LA (r=0.65, 0.63, bothP<0.05), and GRS was negatively correlated with PVCA/LA (r=-0.59,P<0.05). Conclusion 2DSTE can be used to analyze the myocardial strain non-invasively and it has a good correlation with the degree of myocardial fibrosis.

Echocardiography； Hypertension; Speckle tracing echocardiography； Strain； Myocardial fibrosis

上海市科学技术委员会科研计划项目(134119a5801)。

马新欣(1990—)，女，安徽宿州人，在读硕士。研究方向：心脏超声。E-mail： 15000023187@163.com

张跃力，上海交通大学附属第六人民医院超声医学科 上海医学超声研究所，200233。E-mail: zhangyueli2002@163.com

2016-07-08

2016-12-06

实验研究

10.13929/j.1003-3289.201607040

R-332; R540.45

A

1003-3289(2017)02-0161-06