从微生态与心血管损伤关系探讨清热解毒化浊片对肠源性内毒素血症大鼠tPA与PAI-1的影响*

赵国荣戴玉微崔玉晖毛娅男陈研焰艾碧琛肖碧跃何宜荣

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药高等专科学校，湖南 长沙 410208）

·研究报告·

从微生态与心血管损伤关系探讨清热解毒化浊片对肠源性内毒素血症大鼠tPA与PAI-1的影响*

赵国荣1△戴玉微1崔玉晖1毛娅男1陈研焰2艾碧琛1肖碧跃1何宜荣1

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药高等专科学校，湖南 长沙 410208）

目的 从微生态与心血管损伤关系探讨清热解毒化浊片对心与动脉的影响。方法 70只SD大鼠随机分为正常组和造模组，造模组采用高脂、酒精复合因素干预12周建立肠源性内毒素血症（IETM）大鼠模型。造模成功后，按随机数列表法分为模型组、清热解毒化浊片组。经过4周治疗后采血检测内毒素（LPS）水平，观察心肌及主动脉组织病理变化，免疫组化法测定组织型纤溶酶原激活物 （tPA）、纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）在心肌及主动脉组织中的表达。结果 1）与正常组比较，模型组血浆LPS明显升高（P＜0.01）；心肌及主动脉组织PAI-1表达明显升高（P＜0.01）、tPA明显减低（P＜0.01）；2）与模型组比较，清热解毒化浊片组，血浆LPS明显降低（P＜0.01）；心肌组织tPA表达升高（P＜0.05），PAI-1表达明显降低（P＜0.01）；主动脉组织tPA表达明显升高（P＜0.01），PAI-1表达降低（P＜0.05）；光镜下观察，清热解毒化浊片组大鼠心肌及主动脉炎性浸润情况明显改善。结论 清热解毒化浊片可通过降低血浆LPS，协调tPA与PAI-1的平衡，保护肠道菌群失调导致的心与动脉损伤。

清热解毒化浊片 微生态 IETM 心血管 tPA PAI-1

人体存在大量微生物群，它们散布在胃肠道、口腔、皮肤、泌尿道等部位，与其生存的微环境共同组成人体的微生态系统，而肠道是人体最主要和复杂的微生态系统。通过环境条件的相互作用，从物质代谢、免疫调节、营养吸收和屏障作用等多方面影响人体。正常情况下，肠道菌群在肠道屏障和肝脏代谢下维持动态平衡，当肝脏受损使得肠道微生态发生失调，肠道菌种的改变会激活肠道的免疫系统，促进肠道的炎症反应，改变肠道黏膜的通透性，而菌群的代谢物，如致病菌的内毒素进入血循环，对机体产生广泛损伤。这种肠道菌群结构的改变和失衡对心血管疾病的发生发展密切相关。清热解毒化浊片为赵国荣教授创立，投入临床多年证实治疗病毒性免疫性肝损伤疗效确切［1-3］，并且前期实验表明［3-6］清热解毒化浊片可以降低血浆内毒素水平，调节肝细胞脂质代谢，终止肝损伤的恶性循环，在对IETM肝肺损伤大鼠模型复制中也证实［6］其对肺脏也起到可保护作用。而清热解毒化浊片是否对肠道菌群失调导致的心肌与主动脉损伤也有保护作用尚未可知，因此本实验以IETM大鼠为研究对象，观察清热解毒化浊片对大鼠心肌及主动脉tPA、PAI-1的表达及病理改变。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠70只，体质量为（200± 10）g，由湖南中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（湘）2013-0005，合格证号：43004700007002。

1.2 试药与仪器 清热解毒化浊片由湖南中医药大学第一附属医院提供 （批号：20140605），52°红星二锅头由北京红星股份有限公司提供（批号：20140128），大鼠普通饲料及高脂饲料由湖南斯莱克景达实验动物公司提供。高脂饲料配比［8］：77.5%基础饲料+2%胆固醇+ 10%猪油+0.5%胆盐+8%蛋黄粉+2%白糖。鲎试剂由上海润成生物科技有限公司提供；tPA、PAI-1鼠抗体均由武汉博士德生物工程有限公司提供；通用型PV-9000试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；罗氏全自动分析仪，Motic B5显微成像系统，石蜡切片机、摊片机。

1.3 模型制备 70只SD大鼠，随机分为空白组10只和造模组60只。根据文献［9-10］予高脂饲料喂养大鼠，同时每天按10 mL/kg剂量予52°二锅头灌胃1次，并每周称大鼠体质量，按照体质量调整白酒剂量。以血液内毒素（LPS）、心肌及主动脉组织病理切片判断造模成功与否。

1.4 分组及给药 将造模成功后的大鼠按随机数字表法分为模型组（10只）清热解毒化浊片组（10只），清热解毒化浊片组按0.081 g/mL灌胃，模型组及正常组给予等容积蒸馏水灌胃，每组动物灌胃量均为1 mL/ 100（g·d），持续时间为4周。

1.5 标本采集与检测 末次给药结束后，禁食不禁水12 h，麻醉后腹主动脉采血，取血浆检测LPS含量。同时，迅速摘取心肌及主动脉组织，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，用HE染色，光镜下观察心肌及主动脉组织病理学改变；用免疫组化法检测心肌及主动脉中tPA、PAI-1的表达。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件处理。计量资料以（）表示，满足正态性者，组间比较采用单因素方差分析；不满足正态性时选用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌及主动脉组织病理形态学比较

见图1~图2。心肌组织光镜可见：正常组大鼠心肌组织结构正常，未见变性、坏死炎细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱，出现炎性细胞浸润、水肿；清热解毒化浊片组大鼠心肌细胞排列较整齐，组织结构较完整，炎性细胞浸润不明显。主动脉组织光镜可见：正常组大鼠主动脉内皮细胞完整，动脉壁内膜光滑无增生，未见炎性细胞浸润。模型组大鼠主动脉壁内膜粗糙、增厚，内皮细胞增生突出，出现炎性细胞浸润。清热解毒化浊片组主动脉壁内略显粗糙，炎性细胞浸润不明显。

图1 各组心肌组织（HE染色，400倍）

图2 各组主动脉组织（HE染色，400倍）

2.2 各组大鼠血浆LPS水平比较 见表1。LPS的检测可以提示模型是否成功。从结果可知，与正常组比较，模型组具有显著性差异（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠tPA、PAI-1的表达比较 见表2，图3~ 6。与正常组比较，模型组大鼠心肌、主动脉组织tP、PAI-1表达存在显著性差异 （P＜0.01）。经过治疗后，与模型组比较，清热解毒化浊片组心肌组织tPA表达升高（P＜0.05），PAI-1表达明显降低（P＜0.01）；主动脉组织tPA表达明显升高 （P＜0.01），PAI-1表达降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠LPS水平比较（）

表1 各组大鼠LPS水平比较（）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n LPS（EU/mL）正常组 10模型组 10 0.033±0.006 0.045±0.006△化浊片组 100.035±0.009**

表2 各组大鼠心肌、主动脉组织tPA、PAI-1表达比较（）

表2 各组大鼠心肌、主动脉组织tPA、PAI-1表达比较（）

组别 时间 tPA PAI-1正常组 心 肌 0.329±0.025 0.242±0.016（n＝10） 主动脉 0.293±0.029 0.032±0.006模型组 心 肌 0.270±0.021△△0.315±0.037△△（n＝10） 主动脉 0.361±0.019△△0.045±0.006△△化浊片组 心 肌 0.309±0.022*0.253±0.033**（n＝10） 主动脉 0.302±0.031**0.035±0.009*

图3 各组大鼠心肌组织PAI-1阳性表达观察（免疫组化，400倍）

图4 各组大鼠主动脉组织PAI-1阳性表达观察（免疫组化，400倍）

图5 各组大鼠心肌组织tPA阳性表达观察（免疫组化，400倍）

图6 各组大鼠主动脉组织tPA阳性表达观察（免疫组化，400倍）

3 讨 论

3.1 中医心脾与西医心肠生理上的关系 在现代研究中，中医的脾胃功能与肠道菌群有着密不可分的关系。脾胃为气血生化之源，胃主受纳食物，脾主运化将水谷化为精微，把食物的消化吸收及精微的输布全身，使得脏腑组织得到营养。正常的肠道菌群能够参与胆汁酸的肝肠循环，帮助食物的消化吸收，起到营养作用，这即同于脾胃腐熟水谷并散精的功能。而且中医的“脾胃”还包括大小肠功能，小肠主受盛化物和秘别清浊，大肠主传化糟粕，大小肠的正常的运行需依靠脾胃脏腑气机升降之枢纽。因此，大小肠是脾胃功能的进一步延伸，故肠道菌群虽部位在肠，功能属脾胃。

关于中医的心与西医的心的认识，心是主血脉，全身的血，都在脉中运行，依靠心气推动输送全身发挥濡养作用；这与现代医学的心脏认识有一致之处，心脏是血液循环的动力器官，在生命活动中，向器官、组织提供充足的血流量，以供氧和供能来维持细胞的正常代谢和功能。但中医的心还包括主神志，也与心主血脉生理功能密切相关的，血液是神志活动的物质基础，如《灵枢·营卫生会》说“血者，神气也”。因此，可知中医心的功能包含于西医的心的功能。

中医整体观里，人体是一个互相联系的整体，各脏腑之间关系紧密，生理上互相依赖，病理上互相影响。脾胃属于中焦，心脏居于上焦，二者以隔为界，因经脉相连，经气互通，并且脾胃属土，心属火，心为脾之母，脾为心之子，心与脾为母子关系，心病可传脾，脾胃失调也可影响心，母病及子，子病及母。心主血主脉，脾主运化主统血，运化水谷输布精微营养五脏，并能生血统血维持气血的正常运行。由此可知，心脉气血与脾的盛衰息息相关。

3.2 高脂、酒精饮食是IETM形成的物质基础 研究表明［11］，肠道菌群参加了宿主体内糖、脂、蛋白质等多种营养物的代谢，益于肠道消化，能够调节宿主能量代谢及维护肠黏膜正常功能等。而宿主的生活方式、饮食结构等因素的发生变化可以引发肠道菌群的结构改变，使肠道内毒素水平升高，并且长期食用高脂、酒精饮食会导致原发性肝脏损伤。因此，肠源性内毒素在原发性肝损伤基础上进入体循环形成IETM，引起促炎因子瀑布式释放，在全身形成炎性反应，从而使心、肝、肺重要脏器均受损害。

3.3 IETM引发的全身炎性反应对心血管的影响 目前观点认为［12-13］，动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，高脂饮食及伴随的内毒素血症和血管内免疫是重要的始动和影响因素之一。肠道菌群紊乱后肠道内的内毒素过多损伤肠黏膜屏障，并可能通过激活Toll样受体信号传导通路，产生TNF-α，IL-6等炎性细胞因子，减少内皮细胞产生tPA，增加PAI-1的生成，形成内皮功能障碍，从而影响动脉粥样硬化的发生。另一方面，高脂肪、高胆固醇食物中富含卵磷脂、胆碱、肉碱等营养素，在通过对血浆心血管疾病相关因子筛查中发现［14］，与卵磷脂代谢相关的3种代谢产物胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺（TMAO）与心血管疾病发生有密切联系。组织纤溶酶原激活物tPA及其负调控因子PAI-1是人体的纤溶系统的重要构成部分，二者之间的生理平衡对血流通畅起着重要调节作用。PAI-1水平的升高，能够促进巨噬细胞释放并且使得纤维蛋白在体内沉积与低密度脂蛋白结合，刺激血管平滑肌细胞增生，这些都能促进动脉粥样硬化斑块形成。而导致受损的内皮细胞中PAI-1过度表达与内毒素和血脂升高密切相关。

3.4 清热解毒化浊片通过降低内毒素水平从而减轻心与动脉损伤 西医学认为肠道菌群失调引发的内毒素血症与宿主的饮食结构、生活方式等密切相关，而中医学同样认为，长期肥甘厚味或者贪杯饮酒，使得中焦脾胃运化失调，湿浊壅遏，蕴久生热，热积为毒。笔者前期研究［15-16］发现，中医的“毒”和西医的“内毒素”之间存在着密切相关性。西医的“内毒素”在人体泛滥可以引起全身炎性反应综合征，而中医的湿热浊毒的病变中心虽然在脾胃，但由于热蒸湿动，湿热邪气出现蒸蒙上焦、郁阻中焦、流注下焦，使其病变范围广泛而病情复杂。对于湿热浊毒证，中医选用甘露消毒丹，治疗以分消湿热，清热解毒。清热解毒化浊片是从甘露消毒丹化裁而来，方中连翘轻清透达，黄芩苦寒清泄，两者共清上焦热毒；茵陈清利肝脾湿热，石菖蒲、藿香、白豆蔻行气化湿，悦脾和中，令气畅湿行，四药合而清畅中焦湿热；滑石、木通利湿化浊，使邪从小便而解。全方合清上、畅中、渗下三法，共奏清热解毒，利湿化浊之功，使上中下三焦之邪得以分消。并且我们在前期研究［7］中发现，清热解毒化浊片可以通过降低内毒素水平，减轻IETM导致的肝肺损伤，再次佐证清热解毒化浊片可以清除上中下三焦湿热毒浊。

综上所述，本实验结果显示清热解毒化浊片能够降低内毒素水平，促进tPA的表达，降低PAI-1的表达。清热解毒化浊片治疗肠道菌群所致的心肌及主动脉损伤的机制可能与降低内毒素，协调纤溶系统tPA/ PAI-1之间动态平衡有关。

［1］ 肖碧跃，赵国荣，艾碧琛，等.清热解毒化浊片对病毒性肝炎肝损害疗效观察［J］.湖南中医药大学学报，2010，30（7）：49-50.

［2］ 赵国荣，曹军连，谢静，等.不同剂量清热解毒化浊片对大鼠免疫性肝损伤治疗作用的对比研究［J］.中西医结合肝病杂志，2004，10（1）：23-25.

［3］ 谢静，赵国荣，熊焰，等.清热解毒化浊片对慢性病毒性肝炎湿热内蕴证、肝郁脾虚证疗效的研究［J］.湖南中医学院学报，2003，23（6）：33-35.

［4］ 赵国荣，陈研焰，何宜荣，等.基于肝脾理论探讨肠源性内毒素血症致继发性肝损伤［J］.湖南中医药大学学报，2016，36（1）：44-46.

［5］ 毛娅男，赵国荣，连俊凯，等.清热解毒化浊片对肠源性内毒素血症大鼠肝肺促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的影响［J］.云南中医学院学报，2015，38（6）：17-24.

［6］ 何宜荣，赵国荣，陈研焰，等.清热解毒化浊片对内毒素血症兔血浆内毒素、血常规及Toll样受体4核因子-κB表达的影响［J］.中西医结合肝病杂志，2016，26（5）：284-286.

［7］ 毛娅男，赵国荣，陈研焰，等.清热解毒化浊片对脂肪性肝病大鼠脂肪因子ADP及炎性因子TNF-α、IL-10的影响［J］.中国肝病杂志，2016，8（1）：67-71.

［8］ 谢超敏，谭巧燕，饶子亮，等.结合高脂饲料建立酒精性肝损伤大鼠模型的研究［J］.实验动物科学，2009，26（3）：11-13.

［9］ 张军会，王永辉，周然，等.酒精性脂肪肝大鼠肠源性内毒素血症模型的建立［J］.实用肝脏杂志，2014，17（1）：15-17.

［10］刘庆丰，离中东，施孝金，等.高脂血症非酒精性脂肪肝大鼠模型的建立［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：171-172.

［11］杨晓庆.小鼠肠道菌群代谢产物与糖尿病的相关性研究［D］.乌鲁木齐：新疆医科大学，2010.

［12］刘小伟，孙瑞娟，董尔丹.肠道稳态及相关疾病研究现状与趋势［J］.生物科学进展，2013，44（3）：206-212.

［13］黄修宪，李利华，吴新华.血管内皮细胞与动脉粥样硬化［J］.医学综述，2010，16（18）：2727-2726.

［14］吴红，解玉泉，张亚臣.肠道微生物代谢产物氧化三甲胺与心血管疾病研究进展［J］.临床心血管杂志，2016，32（1）：86-90.

［15］艾碧琛，赵国荣，贺又舜，等.卫气营血阶段性与内毒素血症兔不同时相症状、体征的相关性研究［J］.湖南中医药大学学报，2011，31（3）：20-23.

［16］赵国荣，艾碧琛，贺又舜，等.内毒素血症兔不同时相症状、体征的相关性［C］.全国温病学论坛暨辨治思路临床应用高级研修班论文集，2012：1994-214.

Discussion on the Influence of Tablet Qingrejieduhuazhuo on tPA and PAI-1 in Rats with IETM from the Relation between Micro-ecology and Cardiovascular Damage

ZHAO Guorong，DAI Yuwei，CUI Yuhui，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To discuss the influence of Tablet Qingrejieduhuazhuo on heart and arteries from the relation between micro-ecology and cardiovascular damage.Methods：70 SD rats were randomly divided into the normal group and the model group.Intestinal endotoxemia（IETM）rat models were established by intervention with high fat and alcohol composite factors for 12 weeks in the model group.The successful rat models were randomly divided into the model group and the Tablet Qingrejieduhuazhuo group.After 4 weeks of treatment，the endotoxin level was tested through blood sampling，the pathological changes in myocardium and aorta tissues were observed，the expression of tissue-type plasminogen activator（tPA）and plasminogen activator inhibitor（PAI）in myocardium and aorta tissues were measured by immunohistochemistry.Results：1）Compared with the normal group，plasma LPS increased significantly（P＜0.01）in the model group；expression of PAI-1 increased significantly（P＜0.01），and that of tPA decreased significantly（P＜0.01），in myocardium and aortic tissues；compared with the model group，plasma LPS decreased significantly（P＜0.01）in the Tablet Qingrejieduhuazhuo group；expression of tPA increased（P＜0.05），and that of PAI-1 decreased significantly（P＜0.01）in myocardial tissues；expression of tPA increased significantly（P＜0.01），and that of PAI-1 decreased（P＜0.05）in aortic tissues；2）The inflammatory invasion of myocardium and arteries in rats of the Tablet Qingrejieduhuazhuo improved significantly，observed under the light microscope.Conclusion：This study shows that Tablet Qingrejieduhuazhuo can protect myocardium and arteries damaged by flora disequilibrium in intestinal canal，by reducing plasma LPS and balancing tPA and PAI-1.

Tablet Qingrejieduhuazhuo；Micro-ecology；IETM；Cardiovascular；tPA；PAI-1

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0046-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.013

2016-09-01）

湖南省教育厅重点项目资助（12A101）；湖南中医药大学中医药临床基础重点学科资助

△通信作者（电子邮箱：zhaoguorong1116@sina.com）