心痛方对急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达及心律失常的影响*

欧阳过范金茹周斐然陈 彤谢荣苑王建湘廖建萍

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

·研究报告·

心痛方对急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达及心律失常的影响*

欧阳过1范金茹2△周斐然2陈 彤2谢荣苑1王建湘2廖建萍2

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 通过观察心痛方对急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达及心律失常的影响，探讨心痛方防治急性心肌梗死后心律失常的疗效机制。方法 40只SD大鼠分为假手术组、模型组、心痛方组、硫氮 酮组。采用结扎法制备心肌梗死模型，运用RT-PCR法测定SERCA2a mRNA表达，结扎后心电图检测心律失常。结果 心痛方组能显著增加SERCA2a mRNA表达（P＜0.05），降低心律失常发生率（P＜0.05）。结论 心痛方对急性心肌梗死大鼠具有保护作用，其作用机制可能与增加SERCA2a mRNA的表达，从而降低心律失常发生有关。

心痛方 急性心肌梗死 并发症 钙稳态 SERCA2a mRNA

最新报告，2014年中国急性心肌梗死死亡率：城市55.32/10万，农村68.60/10万［1］，严重危害人类健康。其中，急性心肌梗死后发生的恶性心律失常是致死的重要并发症之一［2］。因此，寻求能防治心肌梗死后心律失常的有效药物，成为科研工作者面临的重要课题。心痛方的前期临床及实验研究证实对冠心病疗效确切，为进一步揭示其防治急性心肌梗死后心律失常的疗效机制，本课题从钙稳态调节着手，对Ca2+通道相关基因SERCA2a mRNA进行了研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠40只，体质量200～250 g，鼠龄8~10周，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2011-003。

1.2 仪器与试剂 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司，BL-420F）；动物人工呼吸机（浙江医科大学仪器实验厂，DH-140）；荧光定量PCR仪（厂家ABI，Step One Plus）；台式高速冷冻离心机（Heal Force，Neofuge 15R）；PCR试剂盒、PCR引物 （武汉谷歌生物试剂有限公司提供）。

1.3 实验药物 心痛方中药超微颗粒（柴胡、瓜蒌、川芎、桃仁、蒲黄、白芥子、郁金、九香虫、甘草）购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，批号：681211。硫氮酮，湖南中达骛马制药有限责任公司生产，国药准字号：H20065734。

1.4 分组与造模 SD大鼠40只按体质量分层后，再按随机表随机分组，分为假手术组、模型组、心痛方组、硫氮 酮组，每组10只。以结扎冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌梗死模型［3-4］。穿线或结扎后即刻记录心电图，以左室前壁呈紫绀或Ⅱ导联S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持续0.5 h以上，并于结扎点下心肌颜色改变为结扎成功标志（S-T段无改变者淘汰）。假手术组仅开胸，不结扎。40只大鼠，手术中模型组死亡1只，造模后用药前假手术组、硫氮 酮组、心痛方组各死亡1只，每组纳入实验大鼠为9只。造模用药后假手术组大鼠未出现心律失常及死亡；模型组7只发生心律失常（其中5例室性早搏，1例室速，1例室颤），3只大鼠死亡；硫氮 酮组6只发生心律失常（其中2例室性早搏，2例房性心律失常，1例传导阻滞，1例室速），2只大鼠死亡；心痛方组1只发生心律失常 （室速），1只大鼠死亡，其中死亡大鼠均发生了心律失常。1.5 给药方法 手术后给药7 d（前3 d给药同时予青霉素钠肌注抗感染），均采用灌胃法给药，以60 kg人为标准，参照剂量－体表面积换算方法计算大鼠给药量，药物剂量按大鼠1 mL/100 g灌胃容量配制，心痛方组采用中药超微颗粒冲调成汤剂，浓缩后以1.08 g/kg的剂量给药，硫氮 酮组以2.61 mg/kg的剂量配好药液灌胃，模型组和假手术组均予以等量生理盐水灌服，每天1次，连续7 d，于第7天灌胃30 min后处死大鼠。

1.6 标本采集与检测 1）RT-PCR法测定SERCA2a mRNA表达。取左心室心肌（结扎缺血及坏死区域）约50 mg，将其剪碎，放入1 mL的Trizo液中，用1‰DEPC水浸泡过的电动匀浆器匀浆，Trizo法提取RNA，参考AMV逆转录酶说明书进行逆转录。根据基因库基因序列，以Primer5软件进行设计SERCA2a mRNA和β-actin引物：SERCA2a引物，上游5′-AGATAGCGGG CATACTG-3′，下游5′-TCTATCGCCCGTATGAC-3′，扩增片段长592 bps；β-actin引物，上游5′-CACTATC GGCAATGAGCG-3′，下游5′-GTGATAGCCGTTACTC GC-3′，扩增片段长223 bps。通过凝胶图像分析仪实行吸光度扫描来观察条带的灰度强弱，SERCA2a mRNA吸光度值同GAPDH吸光度的比值来表示结果。2）大鼠心律失常、死亡的观察。观察大鼠心律失常、死亡的发生：常规记录在第1次在造模（或假手术）成功后给药前；第2次在给药后第7天，大鼠处死前。并根据实际情况随时记录。

1.7 统计学处理 应采用SPSS17.0统计软件处理。所有实验数据以（）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，率的比较采用χ2检验，两者相关关系分析采用秩相关Kendall法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心痛方对急性心肌梗死大鼠心肌内 SERCA2a mRNA表达的影响 见表1。与假手术组比较，模型组、硫氮 酮组、心痛方组ERCA2a mRNA表达均减少（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，硫氮 酮组、心痛方组ERCA2a mRNA表达增加（P＜0.01），与硫氮 酮组比较，心痛方组ERCA2a mRNA表达增高（P＜0.05）。30只大鼠SERCA2a mRNA PCR扩增曲线见图1。

表1 心痛方对大鼠急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达的影响（）

表1 心痛方对大鼠急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达的影响（）

与假手术组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与硫氮 酮组比较，#P＜0.05。下同。

组别 n SERCA2a mRNA假手术组 9模型组 6硫氮酮组 7 1.56±0.23 0.69±0.14△△1.07±0.16△△**心痛方组 81.32±0.17△**#

图1 各组大鼠SERCA2a mRNA PCR扩增曲线

2.2 心痛方对急性心肌梗死大鼠并发心律失常、死亡的影响 见表2。与假手术组比较，模型组及硫氮 酮组心律失常发生率明显增高（P＜0.01），心痛方组心律失常发生率无明显差异（P＞0.05）。与模型组比较，心痛方组心律失常发生率明显降低（P＜0.05），硫氮 酮组差异无统计学意义（P＞0.05）。与硫氮 酮组比较，心痛方组心律失常发生率明显降低（P＜0.05）。各组死亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 心痛方对大鼠急性心肌梗死大鼠并发死亡、心律失常的影响n（%）

2.3 急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表达与心律失常相关性分析 未发生心律失常大鼠SERCA2a mRNA基因表达为（1.37±0.28）高于心律失常组的（0.79± 0.20）（P＜0.05），心律失常与SERCA2a mRNA基因表达呈负相关（P＜0.01）。

3 讨 论

冠心病属中医“胸痹心痛”范畴，病机为本虚标实，虚实夹杂。急性心肌梗死时以邪盛标实（痰瘀）为主，后期发展多因实致虚，虚实夹杂，痰饮瘀血交阻常常引发心悸。研究发现［5-7］，中药能有效防治急性心肌梗死后心律失常发生。

心律失常是急性心肌梗死常见的并发症之一［8-9］，具有较高的死亡率。研究提示，其发病的过程可能是钙稳态失衡，Na2+-Ca2+交换诱导细胞产生动作电位，从而引起心脏的异常电信号传导或收缩［10］。心肌Ca2+浓度增加可能是急性心肌缺血早期室性心律失常的主要机制［11］。SERCA是心肌肌浆网Ca2+-ATP酶，主要保持细胞内Ca2+浓度的稳定，当SERCA2a表达增强时，钙超载减少，因而对心肌具有明显的保护作用［12］。本研究提示，大鼠心肌梗死后发生了SERCA2a活性变化，硫氮 酮组及心痛方组可增加SERCA2a活性。心律失常组大鼠SERCA2a mRNA表达明显低于未发生心律失常组，提示心律失常发生与SERCA2a活性密切相关，两者关系呈负直线相关。此外，与模型组比较，心痛方组能减少大鼠心律失常发生率。综上可知，心痛方组能通过增加SERCA2a活性，从而减少心律失常发生。

心痛方是临床上治疗不稳定型心绞痛的有效验方，临床疗效确切，前期动物实验从炎症反应通路证实心痛方能缩小大鼠心肌梗死面积，抑制PLT-WBC相互反应，从而对受损心肌有保护作用［13-15］。方中以柴胡、栝蒌为君药，柴胡遵“木郁达之”之旨，疏肝解郁，栝蒌清热化痰，宽胸散结，二药相合，一以治肝兼治痰瘀，一以治痰散结兼以疏肝，共奏肝心并治之功；川芎、桃仁、蒲黄为臣，川芎搜肝气、补肝血、润肝燥；桃仁活血，生血，缓肝也；蒲黄导瘀结而治气血凝滞之痛，三者并用活血化瘀通络止痛；白芥子、郁金为佐药辅佐君药及臣药，白芥子能利气豁痰、除寒暖中，郁金能行气解郁、泄血破瘀；九香虫为使药，一者取其引经搜剔之功，二者取其活血不碍脾胃之妙；甘草调和诸药。全方共奏理气化瘀、豁痰通络止痛之功效。综上所述，心痛方的疏肝豁痰祛瘀法可能改变了心肌梗死后冠脉的微环境，通过提高SERCA2a活性，调节钙稳态，从而降低心肌梗死后心律失常发生，减少死亡。

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Effect of Xintongfang on the Expression of SERCA2a mRNA and Arrhythmia in Acute Myocardial Infarction Rats

OUYANG Guo，FAN Jinru，ZHOU Feiran，et al.
Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To observe the effect of Xintongfang on the expression of SERCA2a mRNA and arrhythmia in acute myocardial infarction rats to explore the therapeutic mechanism of Xintongfang on arrhythmia after acute myocardial infarction.Methods：40 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，Xintongfang group and diltiazem control group.Acute myocardial infarction model was established by coronary artery ligation method.Expression of SERCA2a mRNA was observed by RT-PCR method and arrhythmia was detected by ECG.Results：The expression of SERCA2a mRNA was obviously increased in Xintongfang group（P＜0.05）；and also the incidence of arrhythmia was decreased（P＜0.05）.Conclusion：Xintongfang has a protective effect on acute myocardial infarction in rats.The mechanism of the effect may be related to its increasing of expression of SERCA2a mRNA in rat，which can help decrease the incidence of arrhythmia.

Xintongfang；Acute myocardial infarction；Complication；Calcium homeostasis；SERCA2a mRNA

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0030-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.009

2016-10-17）

湖南省自然科学基金项目（13jj5031）；湖南省教育厅科学研究项目（16A159）

△通信作者（电子邮箱：fanjr218@sina.com）