复心汤对大鼠原代心肌细胞IP3-Ca2+/CaMCaN通路的影响*

薛一涛陈瑞雪高翔宇孙 德焦华琛

（1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000；2.山东中医药大学，山东 济南 250000）

·研究报告·

复心汤对大鼠原代心肌细胞IP3-Ca2+/CaMCaN通路的影响*

薛一涛1陈瑞雪2高翔宇2孙 德2焦华琛1

（1.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250000；2.山东中医药大学，山东 济南 250000）

目的 研究用复心汤含药血清培养的大鼠原代心肌细胞中IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表达情况，并与缬沙坦干预后的心肌细胞模型进行比较，观察复心汤对心肌细胞的干预效果，进一步探讨复心汤抗心衰的作用靶点及机制，为临床及科研提供一条新思路。方法 健康成年的雄性Wistar大鼠50只，随机分为空白对照组、复心汤低剂量组、复心汤中剂量、复心汤高剂量组、西药（缬沙坦）组，分别给予生理盐水，低、中、高剂量复心汤及缬沙坦每天1次灌胃1周，末次灌胃后腹主动脉采血并分离血清，血清经灭活、滤菌。含药血清干预原代心肌细胞后分别采用Elisa、激光共聚焦成像技术、Western blot法检测心肌中IP3、Ca2+、CaM及CaN的表达情况及或定量分析。结果 复心汤高剂量组及西药组IP3表达量较空白组明显降低，有显著统计学意义（P＜0.01）；复心汤中、高剂量及西药组CaM、CaN表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；与西药组相比，复心汤高剂量组IP3、CaM、CaN表达量差异无显著统计学意义（P＞0.05）；Ca2+荧光探针荧光强度由高到低依次是空白组，复心汤低、中、高剂量组，西药组。表明高剂量复心汤治疗心衰的效果与缬沙坦相当。结论 复心汤治疗心衰可能与IP3-Ca2+/CaM-CaN通路有关。

复心汤 心衰 IP3 Ca2+CaM CaN

慢性充血性心力衰竭 （CHF）是各种心脏疾病导致心脏收缩和（或）舒张功能障碍，心排血量不足而引起的一组综合征，是各种心脏病的严重阶段，在人群中发病率较高［1］，心室重构是其生理病理基础［2］。本实验依托于国家自然科学基金课题 “复心汤提取物干预心衰左室重构的靶向治疗研究”（项目编号：81273703），为该项目第2部分内容，即复心汤含药血清对原代乳鼠心肌细胞钙离子及钙调素依赖的钙调神经磷酸酶通路的影响，通过测定心肌细胞中IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表达，并与缬沙坦干预后的心肌细胞模型进行比较，观察复心汤对心肌细胞的干预效果，进一步探讨复心汤抗心衰的作用靶点及机制，为临床及科研提供一条新思路。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器 复心汤组成：制附子30 g，淫羊藿30 g，泽泻20 g，葶苈子30 g，当归15 g，黄柏15 g。由山东中医药大学附属医院药剂科提供，配制批号：20150409，规格：250 mL/瓶。缬沙坦（规格80 mg×7片，北京诺华制药股份有限公司，批号：H20040217）。α-Actin，山羊血清封闭液 （c-0005），IP3酶联免疫试剂盒，Fluo 4-AM，Pluronic F-127，CaM抗体，CaNA抗体，GAPDH抗体，山羊抗兔IgG，DAPI染液，RNA酶抑制剂，M-MLV逆转录酶，DMEM培养基，青链霉素混合液，D-Hank's液，胎牛血清，胰蛋白酶，Ⅱ型胶原蛋白酶等。

1.2 含药血清的制备 1）含药血清制备：将50只体质量（200±20）g的雄性Wistar大鼠随机分为空白组、复心汤低剂量组、复心汤中剂量组、复心汤高剂量组、西药组，每组10只。实验开始后取Wistar大鼠分别称体质量，参照《药理实验方法学》，人和大鼠间按体表面积折算的等效剂量比值（1∶0.018）计算，大鼠的药物等效剂量为5.94 g/（kg·d）。分别给予低、中、高剂量复心汤及缬沙坦，每天1次灌胃1周，末次给药2 h后水合氯醛麻醉大鼠，无菌条件下腹主动脉取血，取血后立即注入真空采血管，室温静置20 min后3000 r/min离心10 min，分离出的血清即为含药血清。同组血清混合后，置于55℃水浴箱中灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，置于-80℃冰箱中保存备用。2）空白血清制备：空白组灌服0.6 mL生理盐水，每天1次灌胃1周，按照含药血清制备方法，相同处理制备空白血清保存备用。

1.3 原代心肌细胞的分离与纯化 取出生1～3 d Wistar大鼠的乳鼠若干用于实验，超净台下进行以下操作：乳鼠经75%酒精消毒后使用眼科剪与眼科镊开胸取出心脏，将心室部分剪下放入D-Hank′s液中冲洗3次左右。将心肌组织转移至离心管中，将心室肌部分用眼科剪剪成1 mm3的组织块，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液及0.5%Ⅱ型胶原酶按1∶1比例混合3 mL加入已剪碎的心肌组织中，吸管吹打，置于CO2培养箱（37℃，5%CO2，95%空气）中消化5 min，弃去上层混悬液。再次加入消化酶3 mL消化5 min，收集上清液，并加入培养液终止消化。重复消化3次并收集上清液（若心肌组织未消化彻底，可增加消化次数，消化总时间应尽可能小于30 min）。将细胞混悬液经200目孔径不锈钢滤网过滤，离心机离心后，得到心肌细胞，接种于培养瓶中，然后置于CO2培养箱中，差速贴壁1 h。取差速贴壁后细胞悬液用台盼蓝染色计算细胞存活率为91%，倒置显微镜下观察细胞状态后放入CO2培养箱中培养，隔天换培养液，每天观察并记录细胞状态。

1.4 原代心肌细胞的纯度鉴定 α-SA标记心肌肌动蛋白，心肌细胞α-SA抗原表达阳性，呈棕黄色，位于胞浆中，可见细胞核分裂象，表明心肌细胞增殖旺盛。而非心肌细胞呈阴性，计算心肌细胞纯度为90%。见图1。

图1 心肌细胞形态学观察

1.5 心肌细胞形态学观察 倒置显微镜下观察细胞：经分离提取下来的心肌细胞呈圆形或椭圆形，2~4 h后细胞开始贴壁生长，培养24 h大部分心肌细胞已经贴壁，少量心肌细胞出现微弱的搏动现象，其频率和节律不同。培养48 h可见贴壁细胞伸出伪足，呈梭形、三角形或多角形，细胞成簇生长，折光性好，大部分细胞出现搏动现象，搏动频率在每分钟20~100次不等。72 h后多个相邻细胞搏动出现同步化，以每分钟40~60次多见。见图1。第7~10天观察有的细胞搏动频率可达每分钟120次，细胞紧密接触，连成一片。同一个细胞团可能有多个搏动中心，成团心肌细胞的搏动较单个细胞搏动规则。待细胞培养至状态良好时，用含有15%含药血清的培养液进行换液，干预时间为24 h。

1.6 ELisa法检测IP3的表达 根据Elisa试剂盒说明书，分别进行配液备用，加样，加酶标抗体，加底物液显色，终止反应，最后进行检测。

1.7 激光共聚焦技术检测心肌细胞内Ca2+的表达心肌细胞预先接种在六孔板中，每孔放有细胞爬片，细胞培养至第4天用含药血清干预，24 h后进行如下操作：1）Fluo4-AM工作液的配制：用91.2 μL DMSO溶解100 μg Fluo4-AM粉末配制成1 mmol/L的母液，13 mL PBS液稀释65 μL母液配制成5 μmol/L工作液。为加强Fluo4-AM进入细胞的效果，再加入13 μL 20% Pluronic F127至其终浓度为0.02%（工作液即配即用，4℃避光保存）；2）取出六孔板，将培养液弃去，然后用PBS液洗涤细胞3次；3）加入Fluo4-AM工作液覆盖细胞，37℃避光孵育30 min；4）PBS洗涤细胞3次后加入PBS溶液覆盖细胞，再次孵育20 min，以确保AM体在细胞内完全去酯化作用。5）加入DAPI溶液以覆盖细胞为准，37℃避光孵育10 min，PBS溶液洗涤1次。取出细胞爬片，封片并上机检测。激发波长和发射波长分别为488 nm和526 nm。

1.8 Western blot法检测心肌细胞中CaM、CaN蛋白的表达 取出标本，加入RIPA蛋白裂解液后冰浴混匀，冰浴静置30 min。离心：12000 g，30 min。蛋白离心结束后，计算蛋白浓度，转膜（17 kD转膜60 min，62 kD转膜90 min）。先后加入一抗、二抗，分别孵育，并用PBST洗涤。分析各条带灰度值以GAPDH为内参照，计算目的蛋白与同步GAPDH灰度值比值作为相对表达量。

1.9 统计学处理 应用SPSS17.0软件处理及分析。数值资料以（）表示，组间比较釆用t检验。

2 结 果

2.1 Elisa法检测IP3的表达量 见表1。与空白组相比，复心汤低、中、高剂量组及西药组IP3表达量明显降低，有显著统计学差异（P＜0.01）；与复心汤低剂量组相比，高剂量组及西药组IP3表达量明显降低，有显著统计学差异（P＜0.01），而中剂量组无明显差异（P＞0.05），无统计学意义；与复心汤中剂量组相比，高剂量组及西药组IP3表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与复心汤高剂量组相比，西药组IP3表达量降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组IP3表达量及心肌细胞CaM、CaN灰度值比较（）

表1 各组IP3表达量及心肌细胞CaM、CaN灰度值比较（）

IP3 CaM/GAPDH 46.06±4.15 1.595±0.015 14.20±6.03 1.548±0.018 36.57±14.14 1.215±0.105西药组组别 CaN/GAPDH复心汤低剂量组 1.019±0.007复心汤中剂量组 0.939±0.001复心汤高剂量组 0.778±0.257 7.47±1.17 1.110±0.002空白组 271.25±95.62 1.589±0.008 1.020±0.005 0.553±0.005

2.2 激光共聚焦成像技术检测Ca2+的表达 如图2所示，左侧绿色荧光由钙离子荧光指示剂所激发，中间蓝色荧光为细胞核染剂所激发，右侧为绿色荧光与蓝色荧光叠加。图3分别为空白组，复心汤低、中、高剂量组及西药组负载荧光指示剂和细胞核染剂后检测到的图像，可见各组绿色荧光强度逐渐减弱。

图2 空白组（400倍）

图3 各负载荧光指示剂和细胞核染剂后Ca2+的表达（200倍）

2.3 Western blot法测乳鼠心肌细胞CaM、CaN蛋白表达情况 与空白组相比，复心汤低剂量组与复心汤中剂量组CaM表达量均无统计学差异（P＞0.05），复心汤高剂量组与西药组CaM表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与复心汤低剂量组相比，复心汤中剂量组CaM表达量减少，无统计学差异（P＞0.05），复心汤高剂量组与西药组CaM表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与中剂量组相比，复心汤高剂量组与西药组CaM表达量明显减少，有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）；与高剂量组相比，西药组CaM表达量减少，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图4。与空白组相比，复心汤低剂量组CaN表达量减少，差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组及西药组CaN表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与复心汤低剂量组相比，复心汤高剂量组CaN表达量减少，差异无统计学意义 （P＞0.05），复心汤中剂量组与西药组CaN表达量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与复心汤中剂量组相比，高剂量组CaN表达量减少，差异无统计学意义（P＞0.05），西药组CaN表达量明显减少，有显著统计学差异 （P＜0.01）；与复心汤高剂量组相比，西药组CaN表达量减少，无统计学差异（P＞0.05）。

图4 各组CaM、CaN蛋白电泳图

3 讨 论

复心汤方中附子为君药，其性浮而不沉，其用走而不息，上温心阳以通脉，中暖脾胃以健运，下补命门而救阳虚。阳气不足，水运不化，膀胱气化失常，附子温肾阳以逐寒气，化水湿；淫羊藿、葶苈子为臣，淫羊藿补肾阳，强筋骨，祛风湿，本证型心肾阳虚型，肾阳虚可损及肾阴，淫羊藿与附子配伍，可增强附子温补肾阳之功效。葶苈子泻肺降气，祛痰平喘，利水消肿，配伍附子温化痰饮，涤痰定喘。泽泻、当归、黄柏为佐使。纵观全方，附子、淫羊藿温阳补肾，心肾阳气旺盛，心气鼓动有力，则痰饮瘀血得以温化，葶苈子、泽泻利水消肿平喘，四药合用，两补两泻，以补助泻，加之当归补血活血，黄柏燥湿以健脾，使瘀血去，痰饮化，水湿利。

IP3受体是肌浆网上的一种通道蛋白，与IP3结合后其化学构象改变，使Ca2+通道开放，Ca2+被释放入胞浆中，进而开启细胞内钙信号系统。研究表明［13］，心肌细胞发生肥大的一个重要原因是细胞内Ca2+浓度升高。当Ca2+升高时（如收缩期），CaM与Ca2+结合，使得CaM的空间构象发生改变而具有活性，从而激活某些酶类和调节通道的功能。CaN活性是目前发现的唯一受Ca2+/CaM调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，在心脏中表达较高［14］，Ca2+与CnN结合使之具有磷酸酶活性，激活下游传导系统，对心脏中心钠素、脑钠素、α-肌球蛋白重链等基因的特异性表达起调节作用［15］，导致心肌细胞肥大，基因表达及蛋白合成增多，最终发生病理性重构。

本实验采用含药血清干预大鼠原代心肌细胞的方法，观察心肌细胞IP3-Ca2+/CaM-CaN通路的表达。复心汤高剂量组及西药组IP3表达量明显降低，有显著统计学意义 （P＜0.01）；复心汤中、高剂量及西药组CaM、CaN表达量明显降低，有统计学差异（P＜0.01或P＜0.05）；与西药组相比，复心汤高剂量组IP3、CaM、CaN表达量无显著统计学差异 （P＞0.05）；Ca2+荧光探针荧光强度由高到低依次是空白组，复心汤低、中、高剂量组，西药组。表明高剂量的复心汤治疗心衰的效果与缬沙坦相当。综上，复心汤治疗心衰与IP3-Ca2+/ CaM-CaN通路有关。

近些年西医治疗慢性心力衰竭的药物没有明显进展，心衰的高住院率、高死亡率一直是困扰整个社会的难题。中医药对心衰的研究越来越多，而且取得了不错的成绩。本课题通过研究验方复心汤对心衰通路的影响，研究复心汤的作用机制，为复心汤在临床上的应用提供更加有力的证据。为研制出进一步降低心衰住院率、死亡率的药物坚定了基础，从而为广大心衰患者带来福音，同时也对挖掘中医药宝库，促进中医药的现代化研究贡献一份力量。

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Effects of Fuxin Decotion on the Expression of IP3-Ca2+/CaM-CaN Pathway in the Generation of Rat Myocardial Cells

XUE Yitao，CHEN Ruixue，GAO Xiangyu，et al.
Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250000，China

Objective：To study Fuxin Decotion medcated serum on the expression of IP3-Ca2+/CaM-CaN pathway in the generation of rat myocardial cells，and to study the action mechanism of Fuxin Decotion on the effect of cardiac muscle in heart failure.Methods：50 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into blank control group，Fuxin Decotion low-dose group，Fuxin Decotion middle-dose group，Fuxin Decotion high-dose group，valsartan group.Each group was lavaged by saline，Fuxin Decotion low，medium and high dose，and valsartan，every day last a week.At the end of the lavage，collect abdominal aortic blood and separate the serum.The serum was inactivated and filtered from bacteria.The original generation of myocardial cell was intervented by medicated serum in detection of myocardial IP3，Ca2+，CaM，and CaN expression and quantitative analysis respectively by Elisa，laser confocal imaging technology，Western blot method.Results：IP3 expression of Fuxin Decotion high-dose group and valsartan group was obviously lower and it had a significant statistical significance（P＜0.01）；CaM，CaN positive expression area of Fuxin Decotion middle-dose group，Fuxin Decotion high-dose group and valsartan group was obviously lower and it had a statistical significance（P＜0.01 or P＜0.05）；Compared with the valsartan group，IP3，CaM and CaN positive expression area of Fuxin Decotion high-dose group have no statistically significant differences（P＞0.05）；The fluorescence intensity of Ca2+fluorescent probe from high to low in turn is the blank group，Fuxin Decotion low-dose group，Fuxin Decotion middle-dose group，Fuxin Decotion high-dose group，valsartan group.It Shows that “Fuxin Decotion”high-dose group has the effect of valsartan treatment of heart failure.Conclusion：Fuxin Decotion in treating heart failure is related to IP3-Ca2+/CaM-CaN pathway.

Fuxin Decotion；Heart failure；IP3；Ca2+；CaM；CaN

R285.5

A

1004-745X（2017）01-0001-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.01.001

2016-02-19）

国家自然科学基金项目（81273703）