测试片法快速检测乳品中的菌落总数

梁春梅，喻东威，吴玉秋，刘晓川，薛志清，解鑫，赵媛，许璐，扎木则仁

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司中心实验室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

测试片法快速检测乳品中的菌落总数

梁春梅1，喻东威1，吴玉秋1，刘晓川2，薛志清1，解鑫1，赵媛1，许璐1，扎木则仁1

（1.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司中心实验室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

通过用快速菌落总数测试片法与国标方法进行对比,从而对快速菌落总数测试片的准确性、特异性、灵敏度、稳定性等各项性能进行评估，并验证了快速菌落总数测试片与国标方法（GB 4789.2-2010）检测结果的一致性。结果表明，快速菌落总数测试片计数更简单、操作简便，缩短了检测时间，24 h即可对样品进行菌落计数。

快速菌落总数测试片;国标法;乳制品

0 引言

菌落总数测试片是美国3M公司生产的一预先制备好的培养基系统,在食品企业中该系列产品作为微生物日常检测的方法，已经广泛用于食品、饮料及相关行业的微生物检测；

快速菌落总数测试片是培养基中含有作为载体的冷水可溶性凝胶及双联指示剂，使测试片中的菌落显不同颜色。比传统的方法能缩短时间（24 h即可对样品进行菌落计数），且观察结果更简便，有助于提高微生物实验质量和提高工作效率。

本文将快速菌落总数测试片法和国标方法进行对比，考察在检测乳制品样品时两种方法是否存在显著性差异，为乳品企业更好的应用该产品提供有效数据。

1 实验

1.1 材料与设备

生乳80份、奶粉90份、冰激凌10份、纯牛奶（加标）份、奶酪20份、酸性产品（加标）20份，其中加标是指添加一定浓度的标准菌株的产品。

标准菌株大肠埃希氏菌（cicc0389）,金黄色葡萄球菌（cicc21600）。

3MPetrifil mTM快速菌落总数测试片，平板计数琼脂培养基。

生物安全柜,恒温培养箱。

1.2 方法

所有样品均以快速菌落总数测试片法和国标法同时进行试验，其中快速菌落总数测试片法培养时间为24 h（奶粉除外，要求培养48 h），国标法为48 h。

接种标准菌株新鲜培养物至营养肉汤中36℃培养18～24 h，上述培养物用质量分数为0.85%的生理盐水制成每1 mL含菌数为1～1 000 mL-1的菌悬液，备用。

1.3 测定方法

(1)样品试验,本试验对235个样品进行对比。按照国标GB4789.2-2010方法对样品进行稀释，选择2～3个适宜稀释度采用测试片法和国标法分别进行试验。测试片法需36℃培养24 h（奶粉样品需培养48 h），国标方法需36℃培养48 h，记录菌落数量。

(2)重复性实验，随机抽取1个批次的生乳样品采用国标法和测试片法同时检测，分别由不同人员，在不同时间进行检验，分别做20组平行实验。

(3)定量限试验,在检验范围的低限制备5份不同含菌浓度的样品，每份不同含菌浓度的样品分别用测试片法和国标法进行不少于5次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与国标法结果的差异。

(4)线性试验,选择5个浓度的样品，每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。替代方法的相关系数不得低于0.95。

1.4 统计分析

将菌落计数结果转化成常用对数值后，对每类样品进行统计学分析。对对数平均偏差进行配对t检验以确定不同方法之间微生物菌落总数是否有显著性差异。重复性试验用相对标准偏差进行分析，也可用F检验计算得出不同方法的重复性差异。对线性试验结果进行线性回归分析。

2 结果与讨论

2.1 样品实验

本研究采用试片法和国标方法对6种乳制品产品，共235个样品进行菌落总数测定比对，结果分别采用spss软件对样品菌落总数结果进行配对T检验分析如下：

分析结果可知两种方法检测生乳、奶粉、冰激凌、纯牛奶、奶酪等样品相关性分别为：0.963、0.955、0.98、0.984、0.994、0.989；两种方法检测结果具有良好的相关性，且方法之间无显著性差异（P>0.05）。

2.2 精密度实验

取1个纯牛奶样品分装试管，用其稀释活化好的标准菌株（大肠埃希氏菌）稀释至适宜范围，分别用国标方法和测试片法进行计数，此适宜稀释度做20个重复实验。

图1 两种方法精密度实验对比结果

AD判定标准：99%置信水平下AD<1.035，或95%置信水平下AD<0.752,则说明系统服从正态性分布。

图2 精密度实验正态性检验

测试片法精密度试验结果显示，相对标准偏差（RSD%）为7.06%，国标方法检测结果计算相对标准偏差（RSD）为7.82%,两种方法相对标准偏差均符合要求（RSD%<15%）。从图1可知测试片法重复检测结果与国标方法保持很好的一致性。

对检测数据进行正态性检验分析（如图2）得到AD=0.604，小于临界值0.725（95%置信区间），系统服从正态分布，数据处于受控状态。再对其两组数据进行F检验和T检验分析如下：

F检验分析得出F计=0.751，F表（0.05，19，19）= 2.168，F计

t检验分析得出t计=1.500，查表得出t表（0.05，38）= 2.024因t计

2.3 定量限实验

原奶样品和奶粉样品按照10倍梯度进行稀释，选取0 mL-1的样品,1 mL-1的样品,10 mL-1的样品,20 mL-1的样品,50 mL-1的样品,采用测试片法和国标方法分别进行计数。且对检测结果进行统计学分析，结果如表1所示。

表1 成对样本统计量

采用spss软件对数据进行配对T检验分析如下：

由表1可知，采用不同方法对不同菌浓度的纯牛奶样品进行检测，共得到90组数据，其中测试片法测得平均菌落总数对数值为0.8424，标准差为0.73612，标准误差为0.14722；国标方法测得平均菌落总数对数值为 0.8700，标准差为 0.70881，标准误差为0.14176。

表2 成对样本相关系数

由表2和表3可知，采用不同方法对样品进行检测，其相关性为0.990，P>0.05,即不同菌浓度的纯牛奶样品用测试片法和国家标准法测得菌落总数结果无显著性差异，说明测试片法的定量限检测结果符合要求。

表3 成对样本检验

试验同时对1 mL-1左右的20组样品进行检测，测试片法和国标方法检出率均达到80%，测试片法检测限为1 mL-1，灵敏度相当于国标方法。

2.4 线性实验

原奶样品和奶粉样品按照10倍梯度进行稀释，分

别选取1～10，10～30，30～100，100～200，200～300 mL-1的样品采用测试片法和国标方法进行计数。

用国标法和测试片法进行预测，结果R=0.988，R2=0.976，调整R2=0.975，标准估计误差为0.12169。

表4 方差分析结果

表5 回归系数

对数据进行回归线性分析，结果如下。

表4“方差”分析中，“回归”P值为0.000，如果“回归”P值小于0.05是显著的，因此建立的模型是可行的。表5“系数”中计算出的系数的概率值都是小于显著性水平（P）0.05，说明两种方法回归系数达到了显著水平，因此得出测试片法和国标方法具备相关性。由图3可知相关系数R2=0.975，测试片法相关系数不低于0.95，因此测试片法测定菌落总数符合线性关系。

3 结论

图3 3M测试片法和国标法检验结果

实验结果表明快速菌落总数测试片法和国标方法检测纯牛奶、奶粉、酸性产品(包括酸酸乳、真果粒)、冰激凌等产品中的菌落总数，结果无统计学差异（P>0.05）,准确度、精密度、定量限、线性试验均符合要求；快速测试片法检测奶粉样品，48 h会有水化现象，与48 h菌落测试片相比水化程度有所改善，建议奶粉样品24 h预读数，再培养到48 h读数。快速菌落总数测试片可用于酸性产品菌落总数测定，pH值大于4的酸性样品不需要调节。

快速菌落总数测试片采用双联指示剂，使测试片中的菌落显不同颜色计数更简单，操作简便，并且相对传统的测试片方法检测时间为48h缩短至24 h，在更短的时间内获得样品的测试结果，能更加迅速地采取有效的措施解决发现的问题，因此用于乳与乳制品中菌落总数的检测可提高检测效率。

[1]GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[S].

[2]国家药典委员会，中国药典（2010版）:药品微生物检验替代方法验证指导原则.中国医药技术出版社,2010（3）:340-345.

Petrifil mtest piece method o f rapid total colony nu mber count to detect the aer⁃abic p late count in dairy p roducts

LIANG Chunmei1，YU Dongwei1，WU Yuqiu1，LIU Xiaochuan2，XUE Zhiqing1，XIEXin1，ZHAO Yuan1，XU Lu1，Zhamuzeren1
（1.Inner Mongolia Meng N iu Dairy Products Co.,Ltd，Hohhot 010018，China；2.Beijing Anapure BioScientific Co., Ltd,Beijing 100027，China）

The test compared the Petrifilmtest piecemethod of rapid aerabic plate count and national standard method,evaluatedaccuracy, specificity,sensitivity,stability,and other performance attributesof the Petrifil mtest piecemethodof rapid aerabic plate count,and validated the consistency of test resultsof Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic p late count and the national standard method(GB 4789.2-2010). In the test results,the Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic plate count has si mpler colony-counting,more convenient operation,and shorter detection time;it only take 24 hours to start colony-counting.

Petrifil mtest piece;national standard method;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）01-0047-03

2016-09-28

国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ 14037108）。

梁春梅（1983-），女，工程师，从事食品检测及分析工作。