传统藏灵菇发酵乳挥发性风味特征研究

（北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048）

传统藏灵菇发酵乳挥发性风味特征研究

郭婷，郝一江，张健，杨贞耐

（北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048）

采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和气相色谱质谱联用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）检测了采集自西藏和新疆的6个藏灵菇样品作为发酵剂制备的发酵乳的挥发性风味物质，共检出挥发性风味化合物36种，其中有机酸12种，酮类4种，醇类8种，醛类1种，酯类4种，烯烃类1种，烷烃类2种，其他化合物4种。主成分分析显示酸、醇类是Kef3、Kef2和Kef6发酵乳样品的主要挥发性风味物质，乙酸和2-壬酮是Kef5样品区别于其他样品的特异性风味物质，Kef1样品中的二叔丁基对甲酚、异戊醇和2-乙基己醇以及Kef4样品中的苯甲酸、己酸乙酯和十四烷质量分数显著高于其他样品。样品间的聚类和热图分析显示，来源于新疆地区的3组样品具有相似的挥发性风味物质种类和质量分数，各组样品中质量分数较高、种类较多的挥发性有机酸和醇类化合物构成了传统藏灵菇发酵乳独有的特征风味。

藏灵菇发酵乳；挥发性风味物质；气相色谱-质谱联用(GC-MS)；固相微萃取(SPME)

0 引言

藏灵菇是我国牧区常用的乳品发酵剂，其发酵乳具有调节血压和血脂等多种保健功能，是潜在功能性乳品发酵剂来源[1]，工业生产性能受到了广泛关注。

风味是评价乳品发酵剂生产性能的重要指标，是影响消费者选择的首要因素[2]。发酵剂的选择决定产品的风味特性，因此不同发酵乳风味特性一直是乳品研究的热点[3]。目前普通酸奶发酵剂[4]、益生菌发酵剂[5,6]、嗜温型发酵剂、嗜热型发酵剂[7]和辅助发酵剂[8]的主要风味物质研究取得了较好的进展[9]，并初步揭示了主要菌株发酵乳风味物质形成的机制[10]。但对于藏灵菇发酵剂的风味特性报道较少，限制了该类发酵剂工业化生产的应用。

藏灵菇是酵母、乳酸菌、醋酸菌等形成的一个多样的微生物共生体系[11]，其发酵乳具有独特的酸味和香味[12]。本文研究藏灵菇发酵乳的风味特征及不同地区藏灵菇发酵乳风味间的差异，为明确传统藏灵菇发酵乳的风味特征及其形成机理奠定基础。

1 实验

1.1 材料与试剂

藏灵菇（Kef1、Kef2、Kef3采集于新疆牧区，Kef4、Kef5、Kef6采集于西藏牧区）；牛乳。

1.2 仪器与设备

电子天平（PL203），手动固相微萃取进样器（DVB-CAR-PDMS），气相色谱-质谱联用仪。

1.3 藏灵菇发酵乳样品的制备

取低温保存的藏灵菇0.5 g接入质量分数为11%的250 mL经杀菌处理（115℃，15 min）的牛乳培养基中，置于25℃恒温培养箱中静置培养活化20 h后，用无菌生理盐水将藏灵菇冲洗干净，称取0.25 g接种至200 mL已灭菌的牛乳中，25℃发酵20 h。

1.4 顶空固相微萃取发酵乳样品

准确量取10 mL发酵乳样品，加入1 g饱和NaC l溶液于萃取小瓶，放置于45℃水浴中并保持30 min,然后将已老化好的萃取头插入到萃取瓶中进行萃取，富集风味物质30 min后取出纤维头，然后将其插入GC-MS进样口解吸5 min，拔出萃取头进行GC-MS分析。

1.5 GC-MS分析

色谱柱：DB-WAX毛细管柱（30m×250μm，0.25 μm）；进样口温度为250℃。

升温程序：初始温度，40℃，保持2.5 min，以5℃/ min升温到200℃，再以10℃/ min升温到230℃，保持5 min。载气(He)，恒定流速为3 mL/ min，进样口温度250℃，不分流。

质谱条件：电子轰击（electron i mpact，EI）离子源，电子能量70 eV，传输线温度280℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃,质量扫描范围30～400 m/z。

1.6 数据分析

挥发性成分分析：运用N IST14谱库检索，保留匹配度大于或等于800的成分；通过计算保留指数结合文献保留指数进一步对化合物进行定性。化合物定量：按峰面积归一化法计算相对量。数据分析：每个样品均设3次重复，数据以均值±方差表示，采用SPSS12.0软件进行方差分析，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 藏灵菇发酵乳GC-MS检测结果

6种藏灵菇发酵乳的挥发性风味化合物的分析结果如表1所示。共检测出挥发性风味化合物36种，其中有机酸12种，酮类4种，醇类8种，醛类1种，酯类4种，烯烃类1种，烷烃类2种，其它化合物4种。Kef1发酵乳样品含有20种挥发性化合物，其中有机酸9种，醇类5种，其质量分数分别占挥发性化合物总质量分数的36.52%和34.88%；Kef2发酵乳样品含有34种挥发性风味化合物,其中有机酸12种，醇类8种，酮类4种，酯类4种，有机酸的质量分数（51.58%）高于Kef1样品，醇类质量分数（27.22%）低于Kef1样品；Kef3发酵乳样品含有31种挥发性风味化合物,其中有机酸12种，醇类6种，酮类4种，酯类4种，以有机酸（59.17%）和醇类（24.46%）为主；Kef4发酵乳样品含有27种挥发性风味化合物,其中有机酸9种，醇类6种，酮类2种，酯类4种，以有机酸（43.87%）为主,其酯类化合物质量分数（12.99%）高于其他样品；Kef5发酵乳样品含有30种挥发性风味化合物,其中有机酸10种，醇类8种，酮类4种，酯类3种，以有机酸（50.56%）和醇类（23.47%）为主；Kef6发酵乳样品含有33种挥发性风味化合物,其中有机酸11种，醇类8种，酮类4种，酯类4种，质量分数最多的是有机酸（50.19%）。藏灵菇发酵乳改变了牛乳中所含酸、醇、酯等物质种类和质量分数，形成了复杂多样的风味和滋味体系[13]。

（1）酸类化合物。挥发性有机酸主要由乳中脂肪在脂肪酶的作用下水解形成[14]，有显著的特征气味，是发酵乳清爽口感和乳香味的主要来源。本实验检测到藏灵菇发酵乳酸类物质质量分数为36.52%～60.19%，乙酸、丁酸、己酸和辛酸质量分数较高，后三者也是牛乳本底风味脂肪酸[15]，发酵后质量分数增加，这与葛武鹏等的酸奶检测结果一致[16]。乙酸赋予发酵乳淡淡的酸味；丁酸具有多汁味、奶油味；己酸具有油脂味[14]；辛酸具有清香和微弱的水果酸气味，淡酸味[17]。另外，这些脂肪酸还具有抗病毒、抗肿瘤、降胆固醇等生物活性，也是发酵乳中的重要功能组分[18]。

（2）醇类化合物。本研究检测显示各样品中醇类的质量分数为5.37%～34.88%。乙醇由藏灵菇中的酵母无氧代谢产生，其它高分子醇类大部分来自脂肪氧化，由脂肪酶降解乳中的脂肪酸产生[19]。大分子醇类通常具有芳香、植物香、酸败和土气味，但阈值较高，对发酵乳整体风味的贡献较小[20]。

（3）酮类化合物。发酵乳中酮类多为不饱和脂肪酸的氧化、热降解和氨基酸降解产物[21]。样品中酮类质量分数为3.43%～7.21%,该类化合物阈值低，可以赋予发酵乳典型的风味[22]。丁二酮被认为是酸奶风味形成的最主要部分。检测显示藏灵菇发酵乳中挥发性酮类化合物质量分数较少，共发现4种，比刘南南等[23]报道的酸奶中挥发性酮种类少。2-庚酮由亚油酸氧化产生，有奶油气味，是酸奶风味物质中的主要成分；2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的气味；2-十一酮具有蜡香、脂肪香，并带有奶油、乳酪的味道[14]。

（4）醛类化合物。醛类化合物的化学性质比较活泼，属于不稳定的中间体化合物，在一定条件下易被还原成相应的醇，因此通常而言这类化合物在发酵乳中的质量分数都不高。尽管如此，由于这类化合物风味阈值较低，因而仍是酸奶风味中不可缺少的部分。本研究6个样品中均检出苯甲醛，质量分数在0.37%～ 3.99%。据报道苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香气[14]。

（5）酯类化合物。本研究共检出4种酯类化合物，质量分数在2.03%～12.99%。有3种乙酯类化合物，它们是由乙醇和牛乳中的脂肪酸反应产生。己酸乙酯具有强烈的甜的果香、菠萝、香蕉香气，有花香底调，扩散力强，香力持久性一般；葵酸乙酯具有近似于葡萄的香气[14]。

（6）其他化合物。本实验还检测到少量的酚类和硫化物，二甲基二硫是牛奶中的本底风味物质，由β-乳球蛋白和脂肪球膜经光照后产生[24]。二叔丁基苯酚和二叔丁基对甲酚是食品抗氧化剂，在白酒的挥发性物质中有检出，推测由酵母细胞自溶后释放[25]。

表1 藏灵菇发酵乳挥发性风味物质

2.2 藏灵菇发酵乳挥发性风味物质的主成分分析

不同来源藏灵菇发酵乳的风味物质种类质量分数上均有较大差异。挥发性风味物质种类检出最少的Kef1有20种，最多的Kef2有34种。质量分数差异最大的乙酸在样品Kef6和Kef4中检出量为0，而Kef5样品中乙酸质量分数达30.43%。这使得不同来源藏灵菇的发酵乳表现出不同的风味趋向。为明确不同种类挥发性风味物质对藏灵菇发酵乳风味的影响，利用主成分分析法考察了挥发性风味物质与样品间的分布关系，结果如图1所示。

图1 6种藏灵菇发酵乳和33种挥发性风味物质在第一和第二主成分上的分布散点图

图1中，f1和f2主成分的累计贡献率为62.39%，风味物质中酸和醇对f1贡献率分别为43.49%和19.33%，对f2贡献率分别为32.33%和22.52%，另外酯、酮风味物质对f2贡献率分别为11.94%和9.75%，醛风味物质对f1贡献率为6.06%，其他风味物质贡献率较低。样品Kef2，Kef3和Kef6沿第一主成分（f1）正向（>0）分布，在主成分f2方向投影较短，这表明酸、醇类挥发性物质的种类和质量分数占有较大的比重，可能会对风味产生明显影响。Kef5和Kef1分布在f1负方向，较为分散，Kef4是在f2主成分方向投影与其在f1主成分方向投影相接近的样品，说明除了酸和醇类外，其它种类挥发性风味物质可能对其影响较大，具体如图1所示，在Kef4射线附近分布的苯甲酸（9）、己酸乙酯（27）和十四烷（31）在Kef4样品中的检出量均显著高于其它样品（P<0.05）。类似的Kef5样品中乙酸（1）和2-壬酮（22）质量分数，Kef1样品中的二叔丁基苯酚（35）、异戊醇（14）和2-乙基己醇（17）的质量分数显著高于其它样品（P<0.05）。这些挥发性物质种类和质量分数间的差异造成了藏灵菇发酵乳样品风味的不同。

2.3 藏灵菇发酵乳样品的聚类分析

为了进一步明确不同来源藏灵菇发酵乳样品间挥发性风味物质的定量性差异，实验对6组样品进行了聚类分析并绘制了样品中挥发性物质质量分数的热图。由图2可以看出，Kef1、Kef2、Kef3可以很好地聚为一类，而Kef4、Kef5、Kef6则各成一类，这说明通过风味成分的聚类分析，可以基本反映不同藏灵菇发酵乳样品的风味特征。结果显示来源于新疆地区的2组样品Kef2和Kef3风味的种类和质量分数更为接近，这一类主要聚集了酸类和醇类化合物质量分数高，酮类、醛类、酯类质量分数较低的品种。采集自西藏的2组样品Kef4、Kef5分类距离较近，酸类和醇类化合物质量分数较高，酮类、醛类、酯类质量分数次之，对藏灵菇发酵乳风味也具有一定贡献。样品Kef6与其它样品间差异较大。由图2可知藏灵菇发酵乳风味物质涵盖了酸、醇、酮、醛、酯，其中质量分数较高的是酸类和醇类风味物质。

3 结论

采用固相微萃取、GC-MS和主成分分析法，对采集自西藏和新疆的6个藏灵菇样品制备的发酵乳中的挥发性风味物质进行了分析。发现了36种挥发性风味物质，确定了主要的挥发性组分为酸类（36.52%～ 60.19%）、醇类（5.37%～34.88%）、酮类（3.43%～7.21%）、醛类（0.37%～3.99%）、酯类（2.03%～12.99%）及其他化合物。

图2 样品风味物质的热图和聚类分析

研究还发现，藏灵菇样品间挥发性风味物质种类和质量分数存在较大差异，聚类分析的结果显示来源于新疆地区的3组样品间风味的种类和质量分数更为接近，采集自西藏的2组样品分类距离较近，样品Kef6与其它样品间差异较大，产生差异的具体原因，需在明确藏灵菇微生物多样性和丰度差异及其中微生物个体和群体间的风味物质代谢图谱的基础上进一步解析。

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Research on volatile flavor characteristicsof yogurt fer mented by traditional Kefir

GUO Ting,HAO Yijiang,ZHANG Jian,YANG Zhennai
(Beijing Advanced Innovation Cen ter for Food N u trition and H u man H ealth,Beijing Technology and Business Univisty, Beijing 100048,China)

Solid phase microextraction(SPME)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)were used to analyze volatile com⁃pounds in fermented milk prepared by 6 Kefir samples collected fro mdifferent regionsof Tibet and Sinkiang.A total of 36 volatile flavor co mpoundsw ere identified in the 6 yogurt sa mples fermented by traditional Kefir,including 12 acids,4 ketones,8 alcohols,1 aldehyde,4 es⁃ters,1 olkens,2 hydrocarbonsand 4 other co mpounds.The resultsof principal co mponent analysis(PCA)show ed that organic acidsand alco⁃holsw ere themajor volatile co mponents in the sa mples Kef3、Kef2 and Kef6.For sa mple Kef5,acetic acid and 2-nonanone w ere the specific flavor co mpounds.The contentsof butylatedhydroxytoluene、3-methyl-1-butanol、2-ethyl-1-hexanol in Kef1 and benzoic acid、hexanoic acid,ethyl ester and tetradecane in Kef4 w ere significantly higher than other sa mples.The results of cluster analysis show ed that there were si milar contentsand kindsof compondsin the3 samples fro mSinkiang.In all these samples,the organic acidsand alcohol compoundsw ith rel⁃atively higher contentconstitute the unique flavor characteristicsof the traditionalKefir fermented milk.

yogurt fermented by traditional Kefir；volatile flavor components；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；solid phase microextraction(SPME)

TS252.1

A

1001-2230（2017）01-0008-04

2016-06-23

郭婷(1992-)，女，硕士研究生，从事乳制品方面的研究。

杨贞耐