新疆维吾尔族人群SLC22A1基因多态性频率分布及糖尿病家族史对其突变的影响研究

张 莉，占 琼，赵 军，李建光，周 源，杨欢杰，王 宁

·论著·

新疆维吾尔族人群SLC22A1基因多态性频率分布及糖尿病家族史对其突变的影响研究

张 莉1，占 琼2，赵 军3，李建光4，周 源1，杨欢杰1，王 宁5*

背景 转运蛋白(OCT)是近年来备受关注的药物转运体，由SLC22A1基因编码。SLC22A1基因具有显著的遗传多态性，已在多个种族中发现了多个基因突变，是引起2型糖尿病(T2DM)患者二甲双胍生物利用度差异的重要原因。目的 研究新疆维吾尔族青年男性SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点等位基因和基因型的频率分布，以及T2DM家族史对SLC22A1基因突变的影响，为T2DM患者基因导向性二甲双胍个体化治疗提供理论依据。方法 2014年9月—2015年9月，招募新疆维吾尔族男性健康志愿者276例为研究对象。采集受试者外周血5 ml，提取DNA，采用Snapshot技术平台分析受试者SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点等位基因、基因型频率和基因突变情况。结果 SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性(χ2=0.009，P=0.976；χ2=0.246，P=0.620)。亚洲人群、高加索人群、非裔美国人群、新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因及基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因A频率低于高加索人群(P<0.001)。亚洲人群、汉族人群、新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因及基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因T频率高于汉族人群(P<0.017)。19例有T2DM家族史者中12例(63.2%)发生SLC22A1基因突变，208例无T2DM家族史者SLC22A1基因突变率为77.9%(162/208)，差异无统计学意义(χ2=1.367，P=0.242)。结论 新疆维吾尔族男性SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点突变率分别为0.4%、5.8%；未发现T2DM家族史对SLC22A1基因突变产生影响。

糖尿病，2型；生物利用度；SLC22A1基因；多态性，单核苷酸；维吾尔族

糖尿病患者具有较高的患病率和较低的治疗达标率，已成为全球性的公共卫生问题。根据国际糖尿病联合会(IDF)数据，2014年中国有糖尿病患者9 629万人，其中2型糖尿病(T2DM)是糖尿病的主要类型[1-2]。二甲双胍是应用最为广泛的降糖药，也是我国指南推荐的一线用药[3-4]，具有抑制肝糖原合成、改善胰岛素抵抗、保护胰岛B细胞、减轻体质量、调节血脂、保护心血管、降低C反应蛋白(CRP)水平等作用[5-8]。遗传因素是引起T2DM患者二甲双胍生物利用度差异的重要因素，而药物转运体的基因多态性又是其中更为重要的因素。转运蛋白(OCT)是近年来备受关注的药物转运体，是溶质转运体超家族(SLC)重要成员。该蛋白由SLC22A1基因编码，主要在肝脏中表达，可转运二甲双胍进入肝脏，对二甲双胍的药物代谢发挥极其重要作用。研究证明，不同种族SLC22A1～3基因多态性对二甲双胍药动学、药效学、药物间相互作用均有显著影响[9-10]。SLC22A1基因位于染色体6q26，全长37 kb，含有11个外显子和10个内含子。SLC22A1具有显著的遗传多态性，已在多个种族中发现了多个基因突变，相当一部分基因突变可引起其功能改变，且多是导致OCT转运效能降低甚至丧失[11-12]。

新疆维吾尔族人群因地理位置及文化信仰，较少与异族通婚，遗传背景高度同源，是研究基因多态性的理想种族。本研究拟在维吾尔族健康人群中调查SLC22A1常见遗传多态性的分布特征，为后续研究其多态性对二甲双胍药动学、药效学影响，及尝试个体化治疗提供前期准备。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2014年9月—2015年9月，招募新疆维吾尔族男性健康志愿者276例为研究对象，年龄18～25岁，平均年龄(20.9±1.2)岁。纳入标准：(1)年龄18～30岁；(2)志愿者彼此无血缘关系；(3)同意参与本研究。受试者均签署知情同意书，本研究获得新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 方法 由护士采集受试者外周血5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，-80 ℃保存。加入细胞裂解液，10 000 r/min离心2 min(离心半径为8 cm)，向沉淀中加入200 μl缓冲液FG和2 μl蛋白酶K混合液，65 ℃水浴10 min，颠倒混匀。

加入200 μl异丙醇，颠倒充分混匀后以12 000 r/min离心2 min(离心半径为8 cm)。加入500 μl无水乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min(离心半径为8 cm)，重复上一步后将离心管倒置在干净的吸水纸上，空气干燥DNA沉淀(至少5 min)。加入50 μl缓冲液TB，混匀，65 ℃加热10～60 min溶解DNA。核酸蛋白定量仪检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶孔中上样，120 V恒压电泳30 min，使用凝胶成像仪观察并保存结果。

将上述DNA稀释到工作浓度5～10 ng/μl，引物均由欧易生物医学有限公司合成，rs34059508位点引物序列上游：5′- TTCCTCCTGACCCCTGCAGTTT-3′,下游:5′- CACAGGGAGGAACACACCATCA-3′；rs4646277位点引物序列上游：5′- TGACCCACAGAGCTGTGACCTG-3′,下游:5′- AGCAGGAGGCAACTTCCCATTC-3′。PCR反应条件：变性95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s,65 ℃ 40 s,72 ℃ 1.5 min,11个循环;退火94 ℃ 20 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,24个循环后72 ℃ 2 min；延伸：96 ℃ 1 min，96 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，28个循环后保持4 ℃。延伸产物上ABI3730XL测序仪，Gene Mapper 4.1(Applied Biosystems Co.Ltd,USA)分析。

1.3 统计学方法 采用LDA 1.0软件χ2检验判断基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料的分析采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义，多重比较调整检验水准为0.05/比较次数。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性(χ2=0.009，P=0.976；χ2=0.246，P=0.620)。

2.2 不同种族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因及基因型频率比较 亚洲人群、高加索人群、非裔美国人群、新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因及基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05);其中，新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因A频率低于高加索人群，差异有统计学意义(P<0.001，见表1)。

表1 不同种族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因及基因型频率比较〔n(%)〕

Table 1 Comparison of frequency of genotypes and alleles of rs34059508 sites of SLC22A1 gene of different racial populations

种族例数等位基因基因型GAGGGAAA亚洲人群178356(100.0)0178(100.0)00高加索人群200384(96.0)16(4.0)184(92.0)16(8.0)0非裔美国人群200400(100.0)0200(100.0)00新疆维吾尔族人群276551(99.8)1(0.2)275(99.6)1(0.4)0χ2值41.58542.083P值<0.001<0.001

注：亚洲人群、高加索人群、非裔美国人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因及基因型频率数据来源于NCBI dbSNP数据库

2.3 不同种族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因及基因型频率比较 亚洲人群、汉族人群、新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因及基因型频率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，新疆维吾尔族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因T频率高于汉族人群，差异有统计学意义(P<0.017，见表2)。

表2 不同种族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因及基因型频率比较〔n(%)〕

Table 2 Comparison of frequency of genotypes and alleles of rs4646277 sites of SLC22A1 gene of different racial populations

种族例数等位基因基因型CTCCCTTT亚洲人群172340(98.8)4(1.2)168(97.7)4(2.3)0汉族人群170338(99.4)2(0.6)168(98.8)2(1.2)0新疆维吾尔族人群276536(97.1)16(2.9)260(94.2)16(5.8)0χ2值7.4627.600P值0.0240.022

注：亚洲人群、汉族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因及基因型频率数据来源于NCBI dbSNP数据库

2.4 有无T2DM家族史对SLC22A1基因突变的影响 227例受试者具有T2DM家族史资料，SLC22A1基因突变率为76.6%(174/227)。19例有T2DM家族史者中12例(63.2%)发生SLC22A1基因突变，208例无T2DM家族史者SLC22A1基因突变率为77.9%(162/208)，差异无统计学意义(χ2=1.367，P=0.242)。

3 讨论

性别、年龄、身高、体质量等是决定药物反应性的因素，而遗传因素是决定药物反应性的根本因素。药物代谢酶、转运体和受体等药物作用靶点基因变异导致其功能改变，进一步使血药浓度及药物敏感性发生变化[12]。SHU等[13]在细胞和人体内系统中研究了SLC22A1遗传多态性对二甲双胍药物反应性的影响，发现在SLC22A1基因突变的HEK293细胞系中，转染SLC22A1-S16F、SLC22A1-R61C、SLC22A1-S189L、SLC22A1-G220V、SLC22A1-G4015、SLC22A1-420del的细胞系在蛋白量表达相同的情况下，对二甲双胍的转运效能降低。因此，发现新疆维吾尔族人群SLC22A1基因的常见突变类型，可为查明SLC22A1底物药物代谢及药效的个体差异提供信息。

本研究发现维吾尔族人群SLC22A1基因rs34059508位点等位基因G、A分布频率分别为99.8%、0.2%，基因型GG、GA分布频率为99.6%、0.4%，无AA基因型。在亚洲人群中未发现SLC22A1基因rs34059508位点GA基因型，而本研究新疆维吾尔族人群GA基因型频率为0.4%，说明新疆维吾尔族人群基因多态性总体符合亚洲人群基因型，但分布规律也有自身特异性。本研究发现维吾尔族人群SLC22A1基因rs4646277位点等位基因C、T分布频率分别为97.1%、2.9%，基因型CC、CT分布频率为94.2%、5.8%，无TT基因型。本研究SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性，结合上述结论，说明新疆维吾尔族基因多态性总体符合亚洲人群基因型，但多态性分布规律也有自身特异性[14]。新疆维吾尔族SLC22A1基因突变率高，SLC22A1基因rs34059508、rs4646277位点等位基因频率分布尚未见报道，本研究丰富了该基因在我国不同地区、不同种族人群中的分布情况，可为今后进一步的研究提供更详细的资料。

T2DM是由遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂疾病，由于同一家族中的成员具有共同的行为和生活方式，所以家族史可作为研究遗传因素与疾病关系的替代指标[15]。有研究表明，T2DM的遗传度为(83.42±5.84)%，先证者单卵双生后代患T2DM的一致率为50%，异卵者为37%；有家族史者患T2DM的风险是无家族史者的1.56～6.91倍[16-18]。

目前，仅少数T2DM的易患基因(如TCF7L2基因rs7903146位点)在欧洲白种人、墨西哥裔美国人、印度、西非、日本等种族人群得到验证(OR为1.41～1.67)[19-20]。VELASCO MONDRAGON等[15]于2006年首次报道在冰岛、丹麦、美国人群中TCF7L2基因变异(尤其是内含子3、4中的rs7903146和rs12255372位点)与T2DM具有较强的相关性。不同种族的遗传背景及其生存环境存在差异,在不同种族中印证已报道的疾病相关基因或位点对人类复杂疾病病理机制研究具有重要意义[21]。本研究未发现T2DM家族史对SLC22A1基因突变率存在影响，即有无T2DM家族史者基因突变率无差异。

综上所述，本研究初步探讨新疆维吾尔族男性SLC22A1基因突变，可为二甲双胍临床用药的个体化差异提供依据。同时T2DM是多基因遗传疾病，基因多态性可能与T2DM遗传存在一定的关联，需扩大样本研究基因突变位点与糖脂代谢、胰岛B细胞功能和胰岛素抵抗的关系，从而研究T2DM家族史是否增加SLC22A1基因或者其他基因的突变频率。

作者贡献：张莉进行文章的构思与设计、数据整理、统计学处理、撰写论文；占琼、周源、杨欢杰进行数据收集；赵军进行研究的实施与可行性分析；李建光进行论文的修订；王宁进行文章的构思与设计、研究的实施与可行性分析、质量控制及审校。

本文无利益冲突。

[1]CADEDDU C，NOCCO S，DEIDDA M，et al.Cardiopulmonery and endothelial effects of meformin trenlment in all insntin resistant population[J].Int J Cardiol，2012，158(2)：302-304.

[2]江丽欢，陈月婵，霍彩凤.国家基本药物中口服降糖药6种用药方案的药物经济学分析[J].中国药物应用与监测，2013，10(3)：131-134. JIANG L H,CHEN Y C,HUO C F.Pharmacoeconomic analysis on six kinds of regimens using oral antidiabetic drugs in national essential medicines[J].Chinese Journal of Drug Application and Monitoring，2013，10(3)：131-134.

[3]MCLEOD H L，EVANS W E.Pharmacogenomics:unlocking the human genome for better drug therapy[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2001，41:101-121.

[4]American Diabetes Association.Standards of medical care in diabetes-2006[J].Diabetes Care,2006，29(Suppl 1)：S4-42.

[5]DE JAGER J,KOOY A,SCHALKWIJK C,et al.Long-term effects of metformin on endothelial function in type 2 diabetes：a randomized controlled trila[J].J Intern Med,2014，275(1)：59-70.

[6]KAJBAF F,LALAU J D.The criteria for metformin-associated lactic acidosis：the quality of reporting in a large pharmacovigilance database[J].Diabetic Medicine,2013，30(3)：345-348.

[7]HENDRICKX R,JOHANSSON J G,LOHMANN C,et al.Identification of novel substrates and structure-activity relationship of cellular uptake mediated by human organic cation transporters 1 and 2[J].J Med Chem,2013，56(18)：7232-7242.

[8]JONKER J W,SCHINKEL A H.Pharmacological and physiological functions of the polyspecific organic cation transporters:OCT1,2,and 3 (SLC22A1-3)[J].Pharmacol Exp Ther,2004，308(1)：2-9.

[9]唐秀玲.早发2型糖尿病临床特点及相关危险因素分析[J].中国全科医学,2012,15(14):1562-1565. TANG X L.Clinical characteristics and risk factors of early-onset type 2 diabetes mellitus[J].Chinese General Practice,2012,15(14):1562-1565.

[10]KOEPSELL H,ENDOU H.The SLC22 drug transporter family[J].Eur Physiol,2004，447(5)：666-676.

[11]YOON H,CHO H Y,YOO H D,et al.Influences of organic cation transporter polymorphisms on the population pharmacokinetics of metformin in healthy subjects[J].AAPS J,2013，15(2)：571-580.

[12]MARTIN R,GALLET P F,ROCHA D,et al.Polymorphism of the prion protein in mammals:a phylogenetic approach[J].Recent Pat DNA Gene Seq,2009，3(1):63-71.

[13]SHU Y,SHEARDOWN S A,BROWN C,et al.Effect of genetic variation in the organic cation transporter 1(OCT1)on metformin action[J].J Clin Invest,2007，117(5):1422-1431.

[14]TARASOVA L,KALNINA I,GELDNERE K,et al.Association of genetic variation in the organic cation transporters OCT1,OCT2 and multidrug and toxin extrusion 1 transporter protein genes with the gastrointestinal side effects and lower BMI in metformin-treated type 2 diabetes patients[J].Pharmacogenet Genomics,2012,22(9):659-666.

[15]VELASCO MONDRAGON H E,CHARLTON R W,PEART T,et al.Diabetes risk assessment in Mexicans and Mexican Americans:effects of parental history of diabetes are modified by adiposity level[J].Diabetes Care,2010，33(10):2260-2265.

[16]KERB R,BRINKMANN U,CHATSKAIA N,et al.Identification of genetic variations of the human organic cation transporter hOCT1 and their functional consequences[J].Pharmacogenetics,2002，12(8):591-595.

[17]GRANT S F，THORLEIFSSON G，REYNISDOTTIR I,et al.Variant of transcription factor 7-like 2(TCF7L2)gene confers risk of type 2 diabetes[J].Nat Genet，2006，38(3)：320-323.

[18]STEINTHORSDOTTIR V，THORLEIFSSON G，REYNISDOTTIR I，et al.A variant in CDKALI influences insulin response and risk of type 2 diabetes[J].Nat Genet，2007，39(6)：770-775.

[19]LYSSENKO V,LUPI R,MARCHETLI P,et al.Mechanisms by which common variants in the TCF7L2 gene increase risk of type 2 diabetes[J].J Clin Invest,2007,117(8):2155-2163.

[20]VAN VLIET-OSTAPTCHOUK J V,SHIRI-SVERDLOV R,ZHERNAKOVA A,et al.Association of variants of transcription factor 7-like 2(TCF7L2) with susceptibility to type 2 diabetes in the Dutch Breda cohort[J].Diabetologia,2007,50(1):59-62.

[21]INTERACT C,SCOTT R A,LANGENBERG C,et al.The link between family history and risk of type 2 diabetes is not explained by anthropometric,lifestyle or genetic risk factors:the EPIC-InterAct study[J].Diabetologia,2013，56(1):60-69.

(本文编辑：吴立波)

Frequency Distribution of SLC22A1 Gene Polymorphism and Effects of Family History of Diabetes on Mutation in Xinjiang Uygur Population

ZHANGLi1,ZHANQiong2,ZHAOJun3,LIJian-guang4,ZHOUYuan1,YANGHuan-jie1,WANGNing5*

1.TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

2.DepartmentofPostgraduateManagement，GraduateSchoolofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

3.DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

4.UniversityHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

5.DepartmentoftheFirstInternalMedicineintheCadreWards,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China

Background Transport protein is a drug transporter that has attracted much attention in recent years.It is encoded by SLC22A1 gene.SLC22A1 gene has significant genetic polymorphism,and its multiple mutations have been found in many races.It is an important cause of metformin bioavailability differences in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM).Objective To study the frequency distribution of alleles and genotypes of rs34059508 and rs4646277 sites of SLC22A1 gene in Xinjiang Uygur young men,explorer the effects of family history of diabetes on mutation,and provide theoretical basis for individualized treatment of metformin with gene orientation of T2DM patients.Methods From September 2014 to September 2015,276 Uygur male healthy volunteers in Xinjiang were recruited.The 5 ml peripheral blood was collected,and DNA were extracted.The alleles and genotypes of rs34059508 and rs4646277 sites of SLC22A1 gene and nutation among the subjects were analyzed by Snapshot technology platform.Results The frequency distribution of the alleles of rs34059508 and rs4646277 sites of SLC22A1 gene was consistent with the genetic equilibrium of Hardy-Weinberg,which presents group representativeness (χ2=0.009,P=0.976;χ2=0.246,P=0.620).There were significant differences in the frequency of alleles and genotypes of rs34059508 sites of SLC22A1 gene in the Asian population,Caucasian population,African American population,Xinjiang Uygur population (P<0.05);the frequency of allele A of rs34059508 sites of SLC22A1 gene in the Xinjiang Uygur population was lower than that of the Caucasian population(P<0.001).There were significant differences in the frequency of alleles and genotypes of rs4646277 sites of SLC22A1 gene in the Asian population,Han population,Xinjiang Uygur population (P<0.05);the frequency of allele T of rs4646277 sites of SLC22A1 gene in the Xinjiang Uygur population was higher than that of the Han population (P<0.017).SLC22A1 gene mutation occurred in 12 cases(63.2%) among the 19 patients with family history of T2DM,the mutation rate of SLC22A1 gene was 77.9%(162/208) in the 208 cases without family history of T2DM,the difference was not statistically significant (χ2=1.367,P=0.242).Conclusion The mutation rate of rs34059508 and rs4646277 sites of SLC22A1 gene among Xinjiang Uygur men is 0.4% and 5.8% respectively.No effects of family history of T2DM are found on SLC22A1 gene mutation.

Diabetes mellitus，type 2；Biological availability;SLC22A1 gene;Polymorphism,single nucleotide;Uygur nationality

国家自然科学基金资助项目(81360510)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.05.013

2016-08-28；

2016-12-20)

1.830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院

2.830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学研究生学院研究生管理科

3.830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院药学部

4.830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学校医院

5.830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院干部病房内一科

*通信作者：王宁，主任医师，副教授，硕士生导师；E-mall：wnlsdr@163.com

张莉，占琼，赵军，等.新疆维吾尔族人群SLC22A1基因多态性频率分布及糖尿病家族史对其突变的影响研究[J].中国全科医学，2017，20(5)：569-573.[www.chinagp.net]

ZHANG L,ZHAN Q,ZHAO J,et al.Frequency distribution of SLC22A1 gene polymorphism and effects of family history of diabetes on mutation in Xinjiang Uygur population[J].Chinese General Practice，2017，20(5)：569-573.

*Correspondingauthor:WANGNing,Chiefphysician,Associateprofessor,Mastersupervisor;E-mail:wnlsdr@163.com