利用猕猴桃果肉简化“DNA粗提取与鉴定”实验

2017-02-18赵婕

生物学教学 2017年4期

赵婕

(江苏省南京田家炳高级中学 210037)

“DNA的粗提取与鉴定”是人教版高中生物学教材选修一《生物技术实践》中的重要内容。同时，也是现行生物学课程中唯一的分子生物学实验。通过本实验的操作，学生将进一步了解DNA的理化性质，掌握DNA粗提取与鉴定的方法和原理。

1 材料选择

教材中重点介绍的材料是鸡血，但该实验材料有些不足之处：如实验步骤烦琐、成功率较低，学生很难在一节课时间内完成实验；近年禽流感频发，鸡血中可能会携带某些病原体，危害人体健康；材料不易获取和长期保存。同样，其他动物材料也存在类似的不足。其实，该实验也可选择植物材料：如菜花、洋葱和香蕉，但其核DNA数相对较少，在实验中可能效果不太明显。

因此，为了取得较好的实验效果，选择一种替代材料就显得十分重要。经过查阅文献资料[1]，发现猕猴桃中DNA数量较多，取材容易、价格适宜。根据计划，本节内容的讲授时间在12月份左右，正是本市猕猴桃大量上市的季节。因此，猕猴桃可为实验教学提供数量充足、性价比高的实验材料。

2 实验原理

为做好该实验，学生必须进行以下的知识储备：①DNA的物理、化学性质，尤其是DNA的溶解性知识；②DNA粗提取的方法以及DNA提纯的方法；③二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。

实验前，学生已理解DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同，蛋白酶能分解蛋白质，从而使提取的DNA与蛋白质分离，DNA的耐热性比蛋白质强，一定限度内的加热，可以使蛋白质变性，从而与DNA分离。DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质(蛋白质、糖类、脂类、盐类等其他物质)则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含较少杂质的DNA。

教材中介绍用二苯胺法鉴定DNA的方法，教师可以引导学生结合教材中的资料，简单讲述二苯胺法鉴定DNA的化学原理及方法，向学生介绍一下采用其他的方法也可鉴定DNA，如电泳法、紫外灯照射法等。

3 优化过程

3.1 提取DNA的步骤具体如下：

3.1.1 取材将3种猕猴桃(国产猕猴桃、新西兰绿果和新西兰黄金果)置于2℃环境下，24 h后各称取30 g，去皮，切碎。并将碎猕猴桃放入塑封袋中充分研磨。

3.1.2 DNA的溶解与释放在塑封袋中倒入30 mL提取缓冲液(10 mL洗涤液与20 mL 2 mol/L NaCl溶液混合)，2 g嫩肉粉，充分研磨5 min，使缓冲液与猕猴桃细胞充分反应，制成混合物。

3.1.3 除杂将混合物放入60℃的恒温水浴中保温15 min。

3.1.4 过滤将猕猴桃研磨液通过纱布过滤到烧杯中，得到含有DNA的滤液。

3.1.5 DNA的析出取20 mL的DNA滤液，倒入等体积的体积分数为95%的预冷酒精溶液中，沉淀5～10 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。3种猕猴桃实验材料都可以得到较明显的析出粘稠絮状物，且国产和进口猕猴桃析出物差别不大。

3.2 DNA的鉴定将3只试管各加入5 mL 2 mol/L的NaCl溶液，加入提取的DNA，再加入4 mL新配置的二苯胺溶液混匀，沸水浴加热10 min左右，3种猕猴桃都出现明显的蓝色。

4 实验分析

4.1 DNA提取 DNA酶含量在不少种类的细胞中都很高[2]，根据酶的特性，低温下DNA酶的活性降低，降解DNA较少。在实验前将实验材料低温处理，可得到更多析出的DNA。本实验后续也可对实验材料的DNA酶最适温度进行进一步的探究。

4.2 除杂洗洁精中含有SDS(十二烷基硫酸钠)，能够裂解细胞膜，有利于DNA从细胞中释放，具有使蛋白质变性、与DNA分离的作用，有利于提取DNA。大多数蛋白质不能忍受60℃～80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能分解蛋白质但不分解DNA，且作用的最适温度是55℃～60℃。此步骤是成败的关键，可以去除大量的蛋白质、脂肪及多糖等物质。但获得的DNA粗制品滤液中，可能还含有少量核蛋白、多糖和RNA等杂质。如果想进一步提纯DNA，除上述提到的提纯方法外，也可用高盐浓度的溶液溶解DNA(如2 mol/L的NaCl溶液)，能除去在高盐中不能溶解的杂质，用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。

因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够进一步除去与DNA溶解度不同的多种杂质。提纯的方法很多，教学过程中可引导学生搜集有关资料、信息等，进行思维拓展。

4.3 DNA鉴定二苯胺法鉴定DNA时，若溶液呈蓝色，说明实验基本成功。蓝色较深，说明提取的DNA量较多。如果不出现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新进行实验。从实验结果可看出，使用猕猴桃作为实验材料，颜色反应明显，可提取到较多且较纯的DNA，且国内外猕猴桃品种在本实验中没有明显的区别。