多孔壳聚糖固定酵母蛋白酶条件的优化及酶学性质分析

姚晓瑞宁，高飞飞，王 斌，肖 婧，贾晨坤，王顺利，史学伟*

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子，832000；2.石河子大学信息科学与技术学院，新疆石河子，832000；3.新疆唐庭霞露酒庄有限公司，新疆五家渠，831300）

多孔壳聚糖固定酵母蛋白酶条件的优化及酶学性质分析

姚晓瑞宁1，高飞飞1，王 斌1，肖 婧2，贾晨坤1，王顺利3，史学伟1*

（1.石河子大学食品学院，新疆石河子，832000；2.石河子大学信息科学与技术学院，新疆石河子，832000；3.新疆唐庭霞露酒庄有限公司，新疆五家渠，831300）

以多孔壳聚糖微球固定酵母蛋白酶，通过对戊二醛含量、吸附时间、固定化温度、pH进行了单因素试验及正交试验，以蛋白酶酶活回收率为评价指标，确定的固定化条件为戊二醛含量1.4%，吸附温度27℃，pH值为10，吸附时间24 h。在此最佳条件下，固定化酵母蛋白酶酶活回收率为68.8%。酶学性质分析结果表明，固定化酶最佳反应温度较游离酶升高10℃，最佳作用pH较游离酶向碱性方向偏移1个pH单位。因此，用多孔壳聚糖对酵母蛋白酶进行包埋可以提高蛋白酶活性。

多孔壳聚糖；蛋白酶；固定化；酶学性质

酶作为一种天然的高分子催化剂，因其具有极高的专一性、反应条件温和、无污染等优点，在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用前景[1]。然而，游离酶的不稳定和容易变性等缺点限制了其在工业化生产中的应用。固定化酶的研究最早可以追溯到1916年，有学者首先发现被骨碳粉末吸附的酵母蔗糖酶仍具有催化活性[2]。由于传统酶固定化技术存在缺陷，能用于规模生产的还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的几个酶种。

尽管蛋白酶的来源广泛，但是酶稳定性较差，在pH、温度和无机离子等因素的影响下，易变性失活，酶在反应结束之后又难以重复利用，因此难于实现连续化酶反应[3]。固定化酶相比于游离酶稳定性有较大提高，对热、pH等的稳定性也提高，对抑制剂的敏感性降低，易于分离，改善了后处理过程。本研究以多孔壳聚糖微球为载体，固定化酵母蛋白酶，以提高酶的利用率，并对吸附时间、戊二醛浓度、固定化pH、吸附温度进行了探索，制定了蛋白酶固定化的最佳工艺，并对固定化酶特性进行了研究，为蛋白酶固定化研究提供了理论支持。固定化酶相比于游离酶对热、pH等条件的稳定性有所提高，而且对酶抑制剂的敏感性降低，易于分离，改善了后处理过程[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钙、福林酚试剂、三氯乙酸（均为分析纯）：天津致远化学试剂有限公司；氯化钾、氯化铵、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；醋酸、壳聚糖、戊二醇、无水乙醇、Span-80、Tween-60、液体石蜡、乙醚、干酪素、酪氨酸（均为分析纯）：上海浦山化工有限公司；蛋白酶（3 000 U/g）天津市耀华化学试剂有限责任公司。

1.2 仪器与设备

UV-2802SH紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司、PHS-3C精密酸度计：上海精密科学仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂；JJ-1磁力搅拌器：上海国华电器有限公司；FD-1B冷冻干燥机：上海厦美生化科技发展有限公司；CX21FS1光学显微镜：日本Olympus公司。

1.3 试验方法

1.3.1 壳聚糖微球的制备

取2 g壳聚糖干粉充分溶于100 mL冰乙酸（1.7%），在室温下搅拌壳聚糖完全溶解至溶液澄清透明，以100 mL壳聚糖溶液为水相，以488mL甲苯（含7mLSpan-80和2mL Tween-60）为有机相，边搅拌边滴加壳聚糖溶液，混合物1 100r/min搅拌60min形成乳液。随后加入10mL戊二醛溶液继续搅拌固定60 min。最后混合物用蒸馏水充分洗涤直至形成水凝胶状微球，透明无异味为止[6]。收集的微球用不同体积分数（30%、50%、80%、95%、100%）的乙醇脱水，用乙醚干燥后存储于密封袋。

1.3.2 固定化酶的制备

取适量的微球置于三角瓶中，加入pH 10.0硼酸盐缓冲液10 mL，放置24 h，使其充分溶胀，然后抽干备用。添加一定量的蛋白酶溶液，于一定温度吸附适量的时间，然后滴入pH 10.0的硼酸盐缓冲液配制的一定浓度戊二醛溶液，并加入一定量的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为保护剂，一定温度下交联一段时间，剩余的戊二醛溶液倒出[7]，吸干水分冷冻干燥后得到固定化酶。用去离子水洗去固定化蛋白酶中残留的戊二醛，测定其酶活[8]，并计算酶活回收率（recoveryrateofenzymeactivity，RRA），其计算公式如下[9]：

1.3.3 蛋白酶酶活的测定

利用福林-酚法测定蛋白酶的活力[10]。蛋白酶酶活定义：在pH11，40℃条件下，1 min内产生1 mg酪氨酸所需的酶量（g）为一个酶活力单位（U）。

式中：A为样品平行试验的平均OD680nm值；K为吸光常数；4为反应试剂的总体积，mL；10为酶解反应时间，min；n为酶液稀释总倍数。

酪氨酸标准曲线的绘制：将酪氨酸于105℃烘2 h，精确称取0.100 0 g，加少量0.2 mol/L盐酸加热溶解，用蒸馏水定容到1 000 mL（每毫升含酪氨酸100.0 μg），取5支试管，按表1加样，各加入0.4 mol/L碳酸钠5 mL及已稀释福林试剂1 mL，摇匀于40℃恒温水浴锅中发色20 min，以0号管为空白，在波长680 nm处进行比色。以吸光度值OD680nm为纵坐标，以酪氨酸含量（μg/mL）为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线。

表1 酪氨酸标准曲线绘制Table 1 Drawing of tyrosine standard curve

（2）样品中蛋白酶酶活的测定

在试管中加入1 mL酶液，于40℃恒温水浴锅中预热20 min，再加入同样经过预热酪蛋白溶液（精确称取干酪素2.000 g，加入0.1 mol/L NaOH 10 mL，在水浴锅中加热使其溶解，然后用pH 7.2磷酸盐定容至100 mL）1 mL，精确保温10 min，再加入三氯乙酸2 mL以终止反应，继续置于水浴锅中保温20 min，使蛋白质沉淀后离心或过滤，取滤液1 mL，按照标准曲线绘制方法测定样液吸光度值OD680nm。空白对照测定方法同上。在加酪蛋白之前先加三氯乙酸使酶失活再加入酪蛋白溶液。

1.3.4 固定化条件优化单因素试验

分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃条件下固定蛋白酶，加入10 mL、pH值分别为7、8、9、10、11、12硼酸盐缓冲液使其充分溶胀，之后分别加入10 mL酶液，置于不同温度下分别吸附4 h、8 h、14 h、18 h、24 h、28 h，分别加入50%（V/V）的戊二醛使其含量分别为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，于4℃条件下交联12 h后将烧杯中溶液倒出，用去离子水洗去残留的戊二醛，测定其酶活并计算酶活回收率，3次平行试验[11]。

1.3.5 固定化条件优化正交试验

以固定化pH、吸附温度、戊二醛含量和吸附时间为影响因素，以蛋白酶酶活回收率为评价指标，进行4因素3水平的正交试验。正交试验因素与水平见表2。

表2 固定化条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for immobilized conditions optimization

1.3.6 固定化蛋白酶酶学性质分析[12]

（1）最适pH

取适量的游离蛋白酶和固定化蛋白酶，在缓冲液0.2 mol/L、pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的条件下。在40℃条件下测两种酶活力，以游离酶和固定化酶活力最大值为100%，用酪蛋白作为底物，测定游离酶和固定化酶不同pH条件下的相对酶活。

（2）最适反应温度

取适量游离蛋白酶和固定化蛋白酶各自最适pH环境中，不同的温度依次为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃因素中。以游离酶和固定化酶活力最大值为100%，用酪蛋白作为底物，测定游离酶和固定化酶不同温度条件下相对酶活。

（3）固定化酶储存稳定性

称取一定量蛋白酶和固定化蛋白酶，各自最适的温度、最适的pH条件下，分别保存6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d，用酪蛋白作为底物，测定游离酶和固定化酶不同保存时间的相对酶活。

2 结果与分析

2.1 酪氨酸标准曲线

以OD680nm值（y）为纵坐标，酪氨酸溶液的质量浓度（x）为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线见图1。由图1可知，L-酪氨酸标准曲线回归方程为y=0.011 4x+0.001 7，相关系数R2为0.999 2，表明酪氨酸在0～50 μg/mL质量浓度范围内吸光度值之间线性关系良好。

图1 酪氨酸标准曲线Fig.1 Standard curve of tyrosine

2.2 单因素试验结果

2.2.1 吸附温度的影响

图2 吸附温度对酶活回收率的影响Fig.2 Effect of adsorbent temperature on enzyme activity recovery rate

由图2可知，吸附温度在5～30℃时，酶活回收率表现为先增高后下降的现象。当吸附温度在0～25℃时，酶活回收率随着吸附温度的增加而升高；当固定化温度达到25℃时，酶活回收率达到最大64.6%；当吸附温度＞25℃之后，酶活回收率出现降低的现象。因此，最佳吸附温度为25℃。

2.2.2 固定化pH的影响

图3 固定化pH对酶活回收率的影响Fig.3 Effect of immobilized pH on enzyme activity recovery rate

由图3可知，在pH在7～11时，酶活回收率也随着pH值的增大而增加；当pH达到11时，酶活回收率达到最大62%，当pH为11～12时，酶活回收率呈现为下降趋势，可能是因为壳聚糖受pH影响，过高pH会导致壳聚糖的完整性受到破坏。因此，最佳固定化pH值为11。

2.2.3 吸附时间的影响

图4 吸附时间对酶活回收率的影响Fig.4 Effect of adsorbent time on enzyme activity recovery rate

由图4可知，吸附时间在4～18 h时，酶活回收率随着时间增加而增大；吸附时间为24 h时，酶活回收率到达最高值64.6%；吸附时间在18～24 h时，酶活回收率随吸附时间的延长而出现下降。随着交联时间的不断延长，戊二醛与二者的交联反应逐渐达到平衡，载体上的酶蛋白结合位点也不断被饱和，当交联时间进一步增加，固定到载体上的酶蛋白的基本恒定[13]，但是戊二醛对固定化酶蛋白的变性作用依旧存在，并起着主导作用，从而降低了固定到壳聚糖微球上的蛋白酶的活性，最终使得酶活回收率降低。因此，最佳吸附时间为24 h。

2.2.4 戊二醛含量的影响

图5 戊二醛含量对酶活回收率的影响Fig.5 Effect of glutaraldehyde content on enzyme activity recovery rate

由图5可知，戊二醛含量为0.2%～2.2%时，酶活回收率先增高后下降。当戊二醛含量0.2%～1.4%，酶活回收率随戊二醛含量增加有不同程度升高，这是因为戊二醛溶液可以将微球表面和酶分子互相紧密交联，形成酶分子及微球表面牢固的连接在一起，所以酶活回收率增高；当戊二醛含量为1.4%时，酶活回收率为最高64%；当戊二醛含量＞1.4%时，酶活回收率出现降低，这可能因为过高浓度的戊二醛，高浓度的戊二醛溶液中戊二醛内部羟醛缩合反应，产物将会附于微球表面，导致酶的固定化过程难以进行，因而导致酶活回收率下降。因此，最佳戊二醛含量为1.4%[14]。

2.3 正交试验结果

以固定化pH、吸附时间、戊二醛含量和吸附时间为影响因素，以蛋白酶酶活回收率为评价指标，进行4因素3水平的正交试验，其结果与分析见表3。

表3 固定化条件优化优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for immobilized conditions optimization

由表3可知，各因素对结果影响由大到小顺序为C＞D＞A＞B，即戊二醛含量＞吸附温度＞固定化pH＞吸附时间，最优水平组合为A2B3C2D2，即固定化pH值为10、吸附时间24h、戊二醛含量1.4%、吸附温度27℃，在此最佳条件下进行3次验证试验，固定化蛋白酶的酶活回收率是68.6%。

2.4 酶学性质分析

2.4.1 固定化酶的最适pH

图6 固定化酶的最适pHFig.6 Optimum pH of immobilized enzyme

由图6可知，固定化酶和游离酶在以酪蛋白为底物进行反应时的最适pH分别为9和10，游离酶的最适pH比固定化酶的最适pH高了1个值。这可能是因为固定化酶的过程中，壳聚糖分子中含有大量的羟基和氨基，所以制备的壳聚糖微球带有大量的正电荷，这一性质将影响溶液中的负离子集中在扩散层，致使酶分子稳定结构之间的作用力（疏水相互作用力、氢键、离子相互作用等）减弱，所以导致固定化酶的pH值有所降低[15]。

2.4.2 固定化酶的最适反应温度

图7 固定化酶的最适反应温度Fig.7 Optimum reaction temperature of immobilized enzyme

由图7可知，游离酶和固定化酶在30～50℃温度区间，随着温度的上升，酶的活力均表现为增加。但在70～90℃温度区间游离酶活力出现大幅度的降低，所以游离蛋白酶最适温度为50℃，固定化酶最适温度为60℃。由此可知，固定化酶比游离酶的最适温度高了10℃，说明固定化酶的耐热性更高。

2.4.3 固定化酶的储存稳定性

图8 固定化酶的储存性Fig.8 Storage of immobilized enzyme

由图8可知，于4℃、储存11 d对，游离酶以及固定化酶活力分别剩余为15%、48%。由此可知，在相同条件下，显然固定化酶的储存能力大于游离酶，固定化酶储存性得到了明显提高。这是由于固定化酶构象紧密程度升高，减少酶分子内部间的反应过程，并且还可以阻挡外部的环境破坏，所以固定化酶比游离酶具有较高储存性。

3 结论

试验结果表明，固定化蛋白酶最优培养条件为吸附温度27℃，固定化pH值为10，吸附时间24 h，戊二醛含量1.4%。在此最佳条件下，蛋白酶酶活回收率为68.6%。游离酶的最适pH比固定化酶的最适pH提高了1个单位，因此固定化酶表现出更好耐酸性；固定化酶比游离酶的最适温度提高了10℃，因此固定化酶的耐热性较游离酶较高；固定化酶的热稳定性较游离酶有了显著提高；在相同条件下，固定化酶的储存能力大于游离酶，固定化酶储存性得到了明显提高。

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Optimization of immobilized conditions of yeast protease by porous chitosan and analysis of its enzymatic properties

YAO Xiaoruining1,GAO Feifei1,WANG Bin1,XIAO Jing2,JIA Chenkun1,WANG Shunli3,SHI Xuewei1*(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China;2.College of Information Science and Technology,Shihezi University, Shihezi 832000,China;3.Xinjiang Tang-Ting-Xia-Lu Chateau Co.,Ltd.,Wujiaqu 831300,China)

The yeast protease was immobilized by porous chitosan microspheres.The glutaraldehyde content,adsorption time,immobilization temperature and pH were determined by single factor and orthogonal experiments.Using the protease activity recovery as evaluation index,the immobilized conditions were as follows:glutaraldehyde content 1.4%,adsorption temperature 27℃,pH 10 and adsorption time 24 h.Under the optimal conditions,the recovery rate of immobilized yeast protease activity was 68.8%.The results of enzymatic properties analysis showed that the optimum reaction temperature of immobilized enzyme was 10℃higher than that of free enzyme,and its optimal pH moved to alkaline direction by 1 pH unit compared with the free enzyme.Therefore,embedding of yeast protease by porous chitosan could improve the protease activity.

porous chitosan;protease;immobilization;enzymatic properties

Q814.2

0254-5071（2017）01-0146-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.031

2016-10-19

兵团科技攻关计划（2015AB016）；科技和金融结合财政贴息类项目（2016TX49）

姚晓瑞宁（1994-），女，硕士研究生，研究方向为食品安全生物技术。

*通讯作者：史学伟（1980-），男，副教授，博士，研究方向为食品科学生物技术。