研磨法破碎小球藻细胞工艺优化

鲁 龙，毕生雷*，金洪波，吴 娟，张鹏飞

(河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000)

研磨法破碎小球藻细胞工艺优化

鲁 龙，毕生雷*，金洪波，吴 娟，张鹏飞

(河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳473000)

选取破碎过程中的关键因素，以油脂得率为评价指标，通过进行单因素试验和正交试验，对研磨法破碎小球藻细胞的工艺条件进行了研究。结果表明，小球藻细胞破碎最佳工艺条件为藻液质量浓度150 g/L，破碎时间2.5 h，球磨机转速400 r/min，藻液与钢珠的质量比为3:4。在此工艺条件下，能达到较好的破碎效果，油脂得率为46.89%。

小球藻；研磨法；破碎；油脂得率

小球藻（Chlorella）是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门绿藻纲卵囊藻科，现已被广泛养殖[1]。小球藻的主要产物是藻类油脂，它是由甘油三酯和多不饱和脂肪酸组成的，是藻细胞在一定的环境条件下利用碳水化合物等有机物经复杂的代谢反应合成的[2]。将油脂从藻细胞中提取出来与甲醇进行转酯反应，可以制备出具有可再生、环保、安全等优点的生物柴油。

小球藻细胞被较为坚韧的细胞壁所包裹，而油脂大多存在于藻体细胞内，难以直接将油脂提取出来[3]。因此，为提高油脂的提取效率，在提取前需要对藻体细胞进行破壁预处理。目前运用较多的细胞破碎方法可分为机械法和非机械法。机械法包括研磨法、高压均质法、超声法、反复冻融法等[4]，这些方法虽然破壁效率高但存在能耗高的问题；而酸热法、碱热法、酶解法则属于非机械法[4]，这些方法的使用则容易影响油脂的质量，而且废水排放存在着明显的环保压力。因此，现阶段在进行较大规模的细胞破碎时，依旧是机械破碎方法应用比较广泛。

小球藻目前的研究方向主要围绕异养方式培养的小球藻，异养培养方式避免了光自养培养过程中光限制等问题,使得工业化大规模高密度培养微藻成为可能。严佳琦等[5]分别对小球藻进行光合自养、混合营养高碳、混合营养低碳和异养低碳培养，结果表明自养小球藻细胞相比，异养培养的小球藻细胞内蛋白含量显著下降而脂肪含量显著增加。而不同菌株、培养基质以及培养条件对小球藻的影响主要体现在细胞的密度和产物含量方面。周连宁等[6]使用高压脉冲电场破碎小球藻细胞，利用脉冲电场造成的振荡效应使细胞崩坏，最高破壁率为72.51%。DOUCHA J等[7]对比了不同品牌、不同功率、不同容积的匀浆器，分别进行了30 min以上的破壁实验，发现破壁率均在60%以上，随着破壁时间的延长，部分破壁率甚至能够达到90%。HYEON S C等[8]为了从小球藻中提取脂质，用纤维素酶对小球藻进行破壁处理，发现当pH值为5.0，温度为50℃时，酶解72 h，能有效破壁，并且脂质提取率最高为85.3%。邓祥元等[9]采用超声波破碎小球藻提取叶绿素，在超声温度62℃，超声时间2 h的条件下，叶绿素提取量为10.99 mg/g。

本实验使用行星式球磨机通过研磨法破碎小球藻细胞，在球磨机中，钢珠与细胞悬液在高速运转中充分的猛烈碰撞、挤压，具有较高的研磨效率和研磨效果，促使细胞壁破裂，释放出细胞内含物[10]。在实验过程中，系统地研究了破碎过程中的关键因素对小球藻破碎效率的影响，通过单因素试验和正交试验，优化得出使用球磨机破碎小球藻细胞的最佳工艺条件。以期为小球藻的破碎提油过程提供工艺参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

异养小球藻（Chlorella）：清华大学生命科学院提供。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司；酵母粉：安琪酵母有限公司；蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；无水乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；正己烷：郑州派尼化学试剂厂。所有试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.1.3 培养基

发酵培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉3 g/L，KH2PO40.075g/L，MgSO40.075g/L，CaCl20.025g/L，K2HPO40.175g/L，（NH4）2SO41 g/L，Fe2（SO4）33 g/L，ZnSO40.072 g/L，蛋白胨3 g/L，MnCl20.581 g/L，钼酸钠0.044 g/L。

1.2 仪器与设备

50 L发酵罐：上海国强生化工程装备有限公司；101A-3型电热鼓风烘箱：上海森信实验仪器有限公司；DK-S28型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；ME3002E型电子天平：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；R-215型旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；TG16型台式高速离心机：长沙英泰仪器有限公司；XQM型行星式球磨机：长沙天创粉末技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小球藻藻液的培养方法

发酵试验采用50L发酵罐，接种量10%，发酵温度28℃，pH 6.5，通风量2 m3/（L·h），转速为间歇调节（干物质含量＜20 g/L，转速为200 r/min；20 g/L＜干物质含量＜50 g/L，转速为300 r/min；50 g/L＜干物质含量＜70 g/L，转速为400 r/min；干物质含量＞70 g/L，转速为450 r/min），采用间歇补料，葡萄糖含量低于10 g/L时补料[11-14]。发酵15 d，结束后，测得干物质含量为132 g/L，密封后放入4℃的冰箱中备用。

1.3.2 不同质量浓度藻液的配制方法

发酵结束后，小球藻藻液的质量浓度为132 g/L，使用高速离心机7 000 r/min离心15 min，弃去部分上清液，将剩下的上清液和藻泥重新进行混合，使用此方法可将藻液进行浓缩。浓缩后测得藻液的质量浓度为327g/L，在试验中，根据需要的浓度，取一定量浓缩后的藻液，按照一定的比例加水稀释，即可调配出不同质量浓度的藻液。

1.3.3 细胞破碎方法

钢珠与藻液的研磨过程在球磨罐中进行，每个球磨罐容积500 mL，取一定浓度的小球藻发酵液300 g，加入球磨罐中，再加入一定质量的钢珠，钢珠每个直径2 mm，然后盖紧盖子，固定好罐体，设定好转速和时间。球磨罐在机械作用下高速转动，带动钢珠在罐体中剧烈搅动，钢珠与细胞之间的碰撞力和剪切力作用于细胞壁，使细胞破碎释放油脂[15]。

1.3.4 油脂的提取方法

在破碎后的藻液中加入100 mL正己烷和30 mL无水乙醇，振荡摇匀，油脂溶解在有机溶剂中[16]。随后7000r/min离心10 min，弃残渣，将上清液转入分液漏斗中，同样的方法重复3次，将得到的上清液合并至分液漏斗中[16-18]。此时，细胞破碎后释放出的油脂就全部溶解在分液漏斗内的有机溶剂中。

1.3.5 油脂含量的测定

在分液漏斗中，水在下层，有机溶剂在上层，有机溶剂层是溶解了油脂的正己烷和乙醇。将水层放出，留下有机溶剂层，然后转入旋转蒸发仪中将有机溶剂蒸干，留下的即为提取出的小球藻油脂[19-20]。油脂得率计算公式如下：

式中：y为油脂得率，%；m0为破碎的藻液的干物质质量，g；m1为通过试验提取出的油脂质量，g。

1.3.6 单因素试验设计

选取细胞破碎过程中的4个关键因素藻液质量浓度（100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L）、破碎时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、球磨机转速（200 r/min、300 r/min、400 r/min、500 r/min、600 r/min）和藻液量:钢珠质量比（3∶3、3∶4、3∶5、3∶6、3∶7）进行单因素试验，考察这4个因素单独变化时对油脂得率的影响。

1.3.7 小球藻细胞破碎条件优化正交试验设计

根据单因素试验结果，以油脂得率为评价指标，进行L9（34）正交试验，使用SPSS 17.0软件分析试验结果方差，根据分析结果得出细胞破碎的最佳工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 小球藻细胞破碎条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for cell disruption conditions optimization ofChlorella

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 藻液质量浓度对细胞破碎过程的影响

图1 不同藻液质量浓度对油脂得率的影响Fig.1 Effects of differentChlorellaliquid concentration on oil yield

由图1可知，藻液质量浓度越大，细胞破碎后的油脂得率越小，因为藻液质量浓度越大，黏度就越大，这就会影响到钢珠在藻液中的运动速度，钢珠间的碰撞、剪切作用会减弱[21]。藻液质量浓度＞300 g/L后，会完全成为黏稠状，在破碎过程中，会造成钢珠粘连，会严重影响破碎的效果。但是，藻液质量浓度选择过低，藻细胞少，破碎后提取出的油脂也少，会造成试验误差较大，而且工作效率也低，所以选择200 g/L作为破碎时的最适宜藻液质量浓度。

2.1.2 破碎时间对细胞破碎过程的影响

图2 不同破碎时间对油脂得率的影响Fig.2 Effects of different disruption time on oil yield

由图2可知，破碎时间越长，油脂得率越高。但是当破碎时间＞2.0 h后，油脂得率基本维持稳定。这是因为2.0 h后，藻液细胞已经达到最大的破碎程度，进一步增加破碎时间，油脂得率并不能进一步提高。所以选择2.0 h作为细胞破碎时的最佳破碎时间。

2.1.3 球磨机转速对细胞破碎过程的影响

由图3可知，球磨机转速＜400r/min时，转速越高，油脂得率越高；当转速达到400 r/min时，油脂得率达到最大值；当转速＞400r/min之后，油脂得率随着转速继续增大反而有所减少，呈现出下降的趋势。这是因为转速越高，对藻细胞的破碎作用越强，一定时间内球磨机的破碎效率越高，提取油脂后，计算得到的油脂得率就越高。但是转速过快时，会使小球藻细胞集中于球磨罐底部，与球磨珠之间过于分散从而降低破壁效果，同时会消耗大量的能量，会使藻液温度上升，从而导致降温所用的能量也有所上升[22]。所以选择400r/min作为进行破碎时球磨机的转速。

图3 不同转速对油脂得率的影响Fig.3 Effects of different rotate speed on oil yield

2.1.4 藻液与钢珠质量比对细胞破碎过程的影响

图4 不同藻液与钢珠质量比对油脂得率的影响Fig.4 Effects of different mass ratio ofChlorellacell and steel ball on oil yield

由图4可知，当藻液与钢珠质量比在3∶3～3∶5时，钢珠量越多，细胞破碎后，提取油脂得率越高；当藻液与钢珠质量比为3∶5时，油脂得率最高，达到47.16%；当藻液与钢珠质量比为3∶5～3∶7时，钢珠量越多，油脂得率越低。这是因为钢珠越多，彼此之间的剪切力越强，破碎效率也就越高，但是当加入过多时，由于钢珠的相互作用显著，不能使其达到适合破碎的速率分布[23]。所以选择最适宜的藻液与钢珠质量比为3∶5。

2.2 正交试验优化结果

根据单因素试验结果，以油脂得率为评价指标，通过L9（34）正交试验来进行优化，找出最佳的工艺条件。正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，影响小球藻细胞壁破碎的主次因素是破碎时间＞转速＞藻液质量浓度＞藻液与钢珠质量比。各因素的最佳水平是A1B3C2D1，即藻液质量浓度为150 g/L，破碎时间2.5 h，转速400 r/min，藻液与钢珠的质量比为3∶4。在此最佳条件下进行3次验证试验，小球藻油脂得率为46.89%。

表2 小球藻细胞破碎条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for cell disruption conditions optimization ofChlorella

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments result

由表3方差分析可知，破碎时间和转速对小球藻油脂得率影响显著（P＜0.05），藻液质量浓度和藻液与钢珠质量比影响不显著（P＞0.05），这表明在各个因素所考察的范围内，破碎时间和转速是一个重要因素，而藻液质量浓度和藻液与钢珠质量比对小球藻油脂得率影响不大。

3 结论

通过对研磨法破碎细胞的效果进行比较，并对影响细胞破碎的因素进行单因素试验和正交试验可知，使用研磨法破碎小球藻细胞壁的最佳工艺条件为：将藻液质量浓度调配到150 g/L加入球磨罐中，然后按照藻液与钢珠质量比为3∶4的比例加入钢珠，盖紧盖子，固定好罐体后，设置转速为400 r/min，运转时间为2.5 h，启动球磨机进行破碎。按照此工艺条件进行试验，操作简便，藻液处理量大，萃取后，油脂的得率可达到46.89%。本试验优化出的工艺直接使用微藻发酵液进行细胞破碎，是一种简便有效的细胞破碎方法。优化出的研磨破碎工艺可以为微藻油脂的大规模提取提供试验参考，并且对生物柴油的工业化生产及发展有积极的促进作用。在现今国际油价大幅下跌的环境下，微藻生物能源的产业化仍待时日，更需要基础研发与产业化紧密结合，快速推进产业的协同发展。

[1]夏金兰，万民熙，王润民，等.微藻生物柴油的现状与进展[J].中国生物工程杂志，2009，29（7）：118-126.

[2]范馨文，吕淑霞，赵雄伟，等.微生物油脂结构分析及安全性的研究进展[J].食品工业科技，2016，37（10）：368-372.

[3]MERCER P,ARMENTA R E.Developments in oil extraction from microalgae[J].Eur J Lipid Sci Tech,2011,113(5):539-547.

[4]钟韵山，徐仰仓，荆柏林，等.小球藻破壁技术研究进展[J].食品研究与开发，2014，35（14）：120-124.

[5]严佳琦，黄旭雄，黄征征，等.营养方式对小球藻生长性能及营养价值的影响[J].渔业科学进展，2011，32（4）：77-84.

[6]周连宁，刘晓东，余麟，等.不同高压脉冲电场条件对小球藻破壁的影响研究[J].科学技术与工程，2016，16（1）：47-51.

[7]DOUCHA J,LIVANSKY K.Influence of processing parameters on disintegration of chlorella cells in various types of homogenizers[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,81(7):431-440.

[8]HYEON S C,YOU K O,SOON C P,et al.Effects of enzymatic hydrolysis on lipid extraction fromChlorella vulgaris[J].Renew Energ,2012, 12(9):1-5.

[9]邓祥元，成婕，刘孟姣,等.响应面法优化小球藻叶绿素提取工艺及其稳定性研究[J].东北农业大学学报，2015，46（7）：40-49.

[10]钱骅，陈斌，黄晓德，等.不同破壁技术对桑黄功能性成分提取率的影响[J].食品科学，2016，37（10）：23-27.

[11]毕生雷，张成明，金洪波，等.抑菌剂在异养小球藻发酵过程中的应用[J].食品与发酵工业，2015，41（3）：70-74.

[12]毕生雷，张成明，郑世文，等.异养小球藻发酵与树脂调节pH过程耦合工艺[J].中国酿造，2016，35（7）：55-59.

[13]马千然，汪苹.发酵罐高密度异养培养小球藻的研究[J].广东化工，2013，40（4）：15-17.

[14]毕生雷，张成明，李十中，等.异养小球藻半连续发酵生产油脂工艺探讨[J].食品与发酵科技，2014，50（5）：36-40.

[15]郝宗娣，杨勋，时杰，等.微藻生物柴油的研究进展[J].上海海洋大学学报，2013，22（2）：282-288.

[16]TAHER H,AL-ZUHAIR S,AL-MARZOUQI A H,et al.Effective extraction of microalgae lipids from wet biomass for biodiesel production [J].Biomass Bioenerg,2014,66(7):159-167.

[17]张梦，程霞萍，李昌灵，等.三种浸提方法从普通小球藻中提取油脂的比较研究[J].食品工业科技，2013，34（8）：245-248.

[18]宋运猛，彭红，阮榕生，等.微藻油脂提取及其组成含量测定的方法[J].现代化工，2013，33（11）：123-128.

[19]黄达明，孔苗，霍书豪，等.小球藻Chlorellasp.的小分子有机酸/醇培养研究[J].中国酿造，2016，35（2）：29-33.

[20]RONALD H,BRENDAN G,DANQUAH M K,et al.Oil extraction from microalgae for biodiesel production[J].Bioresource Technol, 2011,102(1):178-185.

[21]蒋晓菲，周红茹，金青哲，等.微藻油脂制取技术的研究进展[J].中国油脂，2012，37（12）：62-66.

[22]CHEN Y H,WALKER T H.Fed-batch fermentation and supercritical fluid extraction of hetemtrophic microalgalChlorellaprotothecoides lipids[J].Bioresour Technol,2012,114(1):512-517.

[23]陈俊辉，魏东.异养小球藻对铁、锌和钙的生物富集作用研究[J].现代食品科技，2010，26（11）：192-196.

Optimization ofChlorellacell disruption process by grinding method

LU Long,BI Shenglei*,JIN Hongbo,WU Juan,ZHANG Pengfei(State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology,Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

The key factors were selected in the process of disruption.Using oil yield as evaluation index,the process conditions ofChlorellacell disruption by grinding method were researched through the single factor and orthogonal experiments.The results indicated that the optimum disruption conditions were optimized as follows:Chlorellaliquid concentration 150 g/L,disruption time 2.5 h,rotate speed of ball grinder 400 r/min,the mass ratio ofChlorellaliquid and steel ball 3:4.Under the conditions,the disruption effect was better,and the oil yield was 46.89%.

Chlorella;grinding method;disruption;oil yield

TK6

0254-5071（2017）01-0116-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.024

2016-10-20

“十二五”农村领域国家科技计划（2011BAD14B05）

鲁龙（1988-），男，助理工程师，硕士，研究方向为生物质能源开发。

*通讯作者：毕生雷（1981-），男，工程师，硕士，研究方向为生物化工。