酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

王晓丹，王 婧，朱国军，雷安亮，胡鹏刚，邱树毅*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳，550025；2.贵州珍酒酿酒有限责任公司，贵州遵义，563003；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳，550025；4.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳，550025）

酱香大曲中产四甲基吡嗪细菌的分离鉴定及其功能性研究

王晓丹1,3,4，王 婧1,4，朱国军2，雷安亮2，胡鹏刚1,4，邱树毅1,4*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳，550025；2.贵州珍酒酿酒有限责任公司，贵州遵义，563003；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳，550025；4.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳，550025）

采用稀释平板涂布法从酱香型白酒大曲中分离筛选出细菌菌株19株，模拟酱香型白酒生产发酵工艺，获得2株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法，鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。研究发现，菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性，其中性蛋白酶活力达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相对较高，达139.27 U/g。同时，利用固相微萃取-气质联用技术对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201模拟白酒固态发酵的挥发性香味物质进行分析，发现其中吡嗪类物质相对含量较高，分别为46.01%和48.32%，且均以四甲基吡嗪为主，含量分别为44.11%和47.41%。分离得到的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201可以作为产四甲基吡嗪的功能菌。

酱香；功能细菌；四甲基吡嗪

酱香型白酒中国白酒行业中的一大酒种，其独特的酿造工艺、地理环境造就了酱香型白酒独特的风格特征。高温制曲是酱香型酒特殊工艺之一，许多研究学者都认为高温大曲中的香气，是酱香型白酒中酱香气的主要来源之一[1]。

四甲基吡嗪是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在[2]，国内外酒类的研究者也将这类物质看成是构成酒类风味的重要成分之一。目前，在酱香型白酒中均检测出较高浓度的吡嗪类物质，其中以四甲基吡嗪为主，含量最高[3]。本实验对酱香大曲中的细菌进行分离纯化培养，旨在获得产四甲基吡嗪的功能菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 大曲

酱香型大曲样品：贵州某酒厂储存6个月粉碎后的酿酒车间生产用曲。

1.1.2 试剂

细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司；其他所需试剂为市售分析纯。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.2。

牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.2。

V-P培养基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0～7.2。

糖发酵试验培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，NaHPO4·12H2O 2 g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液12 mL，1%糖，蒸馏水1 000 mL，pH7.4。

柠檬酸盐试验培养基：NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2PO41 g，柠檬酸钠5.0 g，K2HPO41g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，0.2%溴麝香草酚蓝溶液40 mL，pH6.8。

淀粉营养培养基：牛肉膏2.0 g，蛋白17.5 g，淀粉1.5 g，琼脂17.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH7.0。

麸皮培养基[4]：麸皮15 g，15 mL水，搅拌均匀，121℃灭菌20 min。

高粱小麦固体发酵培养基[5]：分别称取高粱与小麦各15 g，加入10 mL水，搅拌均匀，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

YS100光学显微镜：日本尼康株式会社；S-3400N扫描电镜：HITACHI（日立）公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；手动固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）装置：美国Supelco公司；HP6890/5975C气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离纯化

在无菌条件下称取样品大曲10 g，加入已灭菌的生理盐水90 mL，摇床振荡30 min混匀制备成菌悬液。再从中取菌悬液1 mL加入无菌生理盐水，10倍稀释，逐次稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，从不同稀释倍数的菌悬液中取0.2 mL涂布接种于平皿上，其中10-4和10-7倍各做3个平行，10-5和10-6倍各做5个平行，35℃倒置培养1 d[6]。将平皿上长势良好且菌落形态上有较大差异的细菌采用平板划线法将其纯化，然后接入固体斜面培养基上，4℃保存备用。

1.3.2 菌株模拟固态发酵实验

在无菌条件下，将菌株接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，35℃倒置培养24 h后，然后从平板上的单菌落挑取一环移至液体培养基中，35℃摇床培养24 h制备成菌悬液。以10%的接种量将菌悬液加到高粱小麦固体发酵培养基中，按照35℃→40℃→45℃→50℃→55℃的24 h梯度升温静置培养5 d[5]。对照组为接入不含细菌的液体培养液，培养方法相同。菌株固态发酵完成后，对其发酵产物从酸味、酱味和异味等三个方面进行感官评价，筛选出酱香味较浓郁的进行下一步实验。

1.3.3 功能菌株的鉴定

菌株形态学观察：将筛选出产酱香味较浓郁的细菌在平板上活化，再以点接法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，观察其单菌落形态。染色后显微镜观察其菌体形态。

菌株生理生化实验：按《伯杰氏细菌鉴定手册》[7]及《一般细菌常用鉴定方法》[8]对细菌进行生理生化试验。

菌株分子生物学鉴定：根据细菌DNA提取试剂盒说明书，采用细菌16S rDNA通用PCR引物27f（5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGT-TACCTTGTTACGACTT-3′）进行扩增，在25.0 μL聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系中，加上、下游引物1 492r和27f各1.0 μL，Mix 12.5 μL，细菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增条件为初始变性94℃、5 min，然后变性94℃、0.5 min，退火55℃、0.5 min，复性72℃、1.5 min，30个循环，最后延伸72℃、10 min。取2 μL DNA溶液于1%琼脂糖凝胶100 V电泳40 min左右。

测序由上海生物工程有限公司完成，采用16S r DNA测序方法对菌株进行分子鉴定。所得测序结果输入美国国家生物信息技术中心（national center of biotechnology information，NCBI）数据库中进行BLAST比对，用Neighbor-Joining构建目标菌的系统发育树。

1.3.4 菌株功能性研究实验

产蛋白酶活性研究：模拟生产发酵工艺，将筛选出的菌株做菌种产蛋白酶性能实验。先将菌株接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，35℃倒置培养24 h后，从平板上的单菌落挑取一环移至液体培养基中，35℃摇床培养24 h制备成菌悬液。以10%的接种量将菌悬液加到麸皮培养基中。按照35℃、45℃、55℃，24 h梯度升温静置培养3 d[9]。称取10 g固态发酵产物于250 mL三角瓶中，加入90 mL蒸馏水，40℃水浴锅中水浴1 h，其中每隔15 min搅拌一次，经滤纸过滤后获得粗酶液。分别配制乙酸乙酸钠缓冲液（pH 3.0）和磷酸缓冲液（pH 7.2），测定其酸性和中性蛋白酶活力。

1.3.5 测定方法

采用福林-酚法测蛋白酶活力，具体操作步骤参见商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》。

固态发酵产物GC-MS分析：取筛选出菌株经模拟固态发酵后的发酵产物进行GC-MS分析，取样品约1 g，置于4 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMSStableFlex纤维头的手动进样器，在100℃左右顶空萃取30 min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3 min进样。

气相色谱条件：色谱柱为ZB-5MSI5%Phenyl-95%Di-Methylpolysiloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，柱温45℃（保留2 min），以4℃/min升温至220℃，保持2 min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压7.62psi，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间1.5 min。

质谱检测条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70 eV，发射电流34.6 μA，倍增器电压1 125 V，接口温度280℃，质量扫描范围20～450 amu。

定性定量方法：对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，确定了挥发性化学成分，用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

通过平板稀释涂布法，从酱香大曲中分离得到19株菌落形态上有较大差异的细菌，所得结果如表1所示。

表1 细菌菌落形态描述Table 1 Morphological description of bacterial colonies

由表1可知，通过菌落观察能够得到19株形态有明显区别的菌株，用于下一步固态发酵实验的发酵菌株。

2.2 菌株模拟固态发酵实验

菌株固态发酵产物感官评定如表2所示。

由表2可知，细菌进行固态发酵完成后，经感官初步评定筛选出酱香较突出的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201进行后续实验。

表2 菌株固态发酵感官评定结果Table 2 Sensory evaluation results of strains solid-state fermentation

2.3 菌株的鉴定

2.3.1 菌株形态学观察

对筛选出的FBKL1.0199和FBKL1.0201以点接法接种进行培养，观察其菌落形态，结果如图1所示。菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201经染色后，其细胞形态均为杆状，如图2所示。

图1 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain FBKL1.0199(A)and FBKL1.0201(B)

图2 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）细胞形态Fig.2 Cell morphology of strain FBKL1.0199(A)and FBKL1.0201(B)

2.3.2 生理生化实验

菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201生理生化实验结果如表3所示。

表3 菌株生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemical tests results of strains

由表3可知，菌株FBKL1.0199和菌株FBKL1.0201接触酶反应呈阳性，V-P实验呈阳性，能利用葡萄糖、甘露糖产酸，可利用柠檬酸盐，兼性厌氧。参照《伯杰细菌鉴定手册》[7]和《常见细菌系统鉴定手册》[8]，初步认定菌株FBKL1.0199和菌株FBKL1.0201为芽孢杆菌属（Bacillussp.），利用分子生物学手段对其进行进一步的鉴定。

2.3.3 分子生物学鉴定

采用16S rDNA测序方法对菌株FBKL1.0199和FBKL 1.0201菌株进行分子鉴定，对DNA进行序列扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增片段长度约为1500bp。将所得测序结果输入NCBI中进行BLAST比对，用Neighbor-Joining法构建目标菌的系统发育树，结果见图3，根据比对结果菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201与地衣芽孢杆菌相似性达到99%，结合菌落形态及生理生化实验，将其鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

图3 菌株FBKL1.0199、FBKL1.0201系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain FBKL1.0199 and FBKL1.0201

2.4 菌株功能性试验

2.4.1 产蛋白酶活性研究

白酒生产中，蛋白酶是至关重要的一种酶，可将原料中的粗蛋白降解成各种氨基酸，使得大曲中的氨基酸种类和数量增多。丰富的氨基酸是微生物通过代谢合成四甲基吡嗪的前体物质。同时，蛋白酶在白酒的酿造过程中可以促进微生物繁殖以及分解蛋白质、降解微生物菌体蛋白等多种功能，高活力的蛋白酶可以提高白酒的产量和质量[10-15]。因此对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201进行产蛋白酶活性研究，其产酶活力如表4所示。

表4 蛋白酶活力测定结果Table 4 Determination results of protease activity

由表4可以看出，菌株FBKL1.0199其产蛋白酶能力优于FBKL1.0201，两株菌产中性蛋白酶的能力均优于酸性蛋白酶，菌株FBKL1.0199中性蛋白酶活力高达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相对较高，达139.27 U/g，菌株FBKL 1.0199具有高产蛋白酶的特性。

2.4.2 固态发酵产物GC-MS分析

对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201进行了模拟发酵实验，通过固相微萃取与GC-MS联用技术，对其发酵产物的挥发性香味成分进行了测定，其检测结果如图4、表5和表6所示。

图4 菌株FBKL1.0199（A）和菌株FBKL1.0201（B）发酵产物挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.44 Totalion chromatograms of volatile components in fermentation products of strain FBKL1.0199(A) and FBKL1.0201 (B) by GC-MS

由图4A、表5可知，菌株FBKL1.0199发酵产物中，吡嗪类化合物相对百分含量最高，达到了46.01%，其中以四甲基吡嗪为主，含量为44.11%。其次是酮类化合物，含量为29.95%，其中以3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）为主，含量为19.547%。醇类化合物百分含量为13.27%，以1,3-丁二醇为主，含量为10.814%。酚类物质含量为2.57%，醛类物质含量为0.50%，酯类物质含量为0.22%，没有酸类物质，还有一些其他的烷烃类和杂环类和未测定出的化合物，总含量为7.48%。

表5 菌株FBKL1.0199发酵产物GC-MS成分分析结果Table 5 Analysis results of components in the fermentation products of strain FBKL1.0199 by GC-MS

由图4B、表6可知，菌株FBKL1.0201发酵产物所测挥发性成分中，吡嗪类化合物含量最高，达48.32%，以四甲基吡嗪为主，含量达47.41%。其次是酮类物质，含量为30.42%，以2,3-戊二酮主，含量达21.75%，乙偶姻含量仅为0.172%。醇类物质含量为10.98%，2,3-丁二醇和1,3-丁二醇为主。酚类物质含量为1.71%。其他物质占6.34%。

表6 菌株FBKL1.0201发酵产物GC-MS成分分析结果Table 6 Analysis results of components in the fermentation products of strain FBKL1.0201 by GC-MS

综合以上结果，菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201发酵产物挥发性成分中吡嗪类物质含量都较高，均以四甲基吡嗪为主。结合固态发酵产物感官评价，其发酵产物酱香浓郁，因此，可将菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201作为重要的产四甲基吡嗪功能菌。

3 结论

通过稀释涂布法，从酱香大曲中分离得到19株菌落形态上有较大差异的细菌。模拟酱香型白酒生产发酵工艺，通过梯度升温发酵，获得两株固态发酵产物具有浓郁酱香气味的菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201。结合菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法，鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201产蛋白酶活性研究发现，两株菌产中性蛋白酶的能力均优于酸性蛋白酶。菌株FBKL1.0199中性蛋白酶活力高达3 925.80 U/g，酸性蛋白酶活力也相对较高，达139.27 U/g，菌株FBKL1.0199具有高产蛋白酶的特性。菌株FBKL1.0201中性蛋白酶活力达1 377.23 U/g，不产酸性蛋白酶。

对菌株FBKL1.0199和FBKL1.0201固态发酵产物中的挥发性成分采用GC-MS检测，发现其固态发酵产物中吡嗪类物质相对含量非常高，以四甲基吡嗪为主。同时，结合固态发酵产物感官评价，其发酵产物酱香浓郁，这与酱香型白酒中酱香风味的特征性成分以吡嗪类等物质为主的说法相符。

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Isolation and identification of functional bacteria with high yield of tetramethyl pyrazine from Moutai-flavor high-temperatureDaqu

WANG Xiaodan1,3,4,WANG Jing1,4,ZHU Guojun2,LEI Anliang2,HU Penggang1,4,QIU Shuyi1,4*(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.Guizhou Zhenjiu Brewing Co.,Ltd.,Zunyi 563003,China;3.School of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 4.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

By the methods of spread plate from Moutai-flavor high-temperatureBaijiu Daqu,19 bacterial strains were isolated and screened.Two strains of FBKL1.0199 and FBKL1.0201 with rich Moutai-flavor were obtained by simulation of the Moutai-flavorBaijiu(liquor)fermentation process.Combining with the morphology,physiology of strain with biochemical and molecular biology,the strain was identified asBacillus licheniformis.It was found that strain FBKL1.0199 had the characteristics of high yield protease,the protease activity was as high as 3 925.80 U/g, and the acid protease activity was also relatively high,reaching 139.27 U/g.At the same time,the volatile flavor compounds produced by strains FBKL1.0199 and FBKL1.0201 were analyzed using HS-SPME and GC-MS.Results showed that the fermentation products had high relative content of pyrazine compounds,which was 46.01%and 48.32%,respectively.The primary components were tetramethyl pyrazine,and the contents were 44.11%and 47.41%,the strains FBKL1.0199 and FBKL1.0201 can be used as the functional bacteria for tetramethyl pyrazine production.

Moutai-flavor;functional bacteria;tetramethyl pyrazine

TS261.1

0254-5071（2017）01-0055-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.011

2016-02-10

贵州省工业攻关项目（黔科合GZ字[2014]3012）；贵州省省校合作计划项目（黔科合LH字[2014]7672）

王晓丹（1980-），女，工程师，博士，研究方向为应用生物技术。

*通讯作者：邱树毅（1963-），男，教授，博士，研究方向为应用生物技术。