传统工艺山西老陈醋发酵及熏蒸过程中常规成分的变化分析

陈 涛，桂 青,2，郭俊陆，王正刚，陈福生,4*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌571339；

3.山西老陈醋集团有限公司，山西太原030013；4.环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

传统工艺山西老陈醋发酵及熏蒸过程中常规成分的变化分析

陈 涛1，桂 青1,2，郭俊陆3，王正刚3，陈福生1,4*

（1.华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070；2.中国热带农业科学院椰子研究所，海南文昌571339；

3.山西老陈醋集团有限公司，山西太原030013；4.环境食品学教育部重点实验室，湖北武汉430070）

该研究分析了山西老陈醋在传统工艺发酵过程中淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶酶活变化，并对发酵及熏蒸过程中淀粉、总糖、酒精度、总酸、有机酸和氨基酸等常规成分的变化规律与形成机理进行了探讨。结果表明，酒精发酵阶段，4种酶活力变化不大，醋酸发酵阶段，4种酶活力均有所降低；发酵及熏蒸过程中淀粉含量由64.05%降至18.88%；酒精发酵阶段，总糖含量从11.88%降至1.12%，醋酸发酵阶段，总糖含量从2.28%增至7.35%，熏蒸阶段，总糖含量从7.13%降至5.89%；酒精含量在酒精发酵过程中从1.3%vol增至5.7%vol，到发酵22 d时几乎降为0；总酸含量在1～22 d内从1.17%增至10.23%；在发酵及熏蒸过程中醋酸含量从1.03 mg/g增至76.25 mg/g；酒精发酵阶段，乳酸含量从1.94 mg/g增至60.60 mg/g，随后含量变化较小。

山西老陈醋；传统工艺；常规成分；分析

山西老陈醋是我国传统的四大名醋之一，其独特生产工艺的确立已有300多年的历史，被列为国家级非物质文化遗产，产品具有有机酸组成丰富、氨基酸含量高、品质和风味优良等特点[1]。山西老陈醋的传统生产工艺，以高粱、麸皮为主要原料，以谷糠为辅料，以大麦、豌豆为原料制作的大曲作为糖化发酵剂，高粱、大曲、麸皮和谷糠的比例为100:62.5:70:100，生产工艺包括原料处理、拌曲、（糖化）酒精发酵、醋酸发酵、熏蒸（醋醅）、淋醋、陈酿等步骤[1]。整个生产过程，除淋醋和陈酿阶段外，历经31 d，其中1～16 d为酒精发酵，17～25 d为醋酸发酵，26～31 d为熏蒸。其中熏蒸是传统山西老陈醋生产中一道特有的工序，在这一过程中醋醅由黄色变为深褐色，能增加醋的色泽和焦香味，对传统山西老陈醋色、香、味的形成具有重要的作用[2]。

关于食醋生产过程中常规成分的变化分析已有很多报道[3-9]。但对山西老陈醋在发酵及熏蒸过程中常规成分的变化研究报道很少。本研究分析了山西老陈醋在发酵及熏蒸过程中糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等酶活变化，并对发酵及熏蒸过程中淀粉、总糖、还原糖、酒精度、总酸、有机酸和氨基酸态氮等成分变化规律与形成机理进行了分析。研究结果对山西老陈醋传统生产工艺的改良具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品均取自山西老陈醋集团有限公司传统工艺生产车间。在发酵的第1、3、5、8、11、14、16天（酒精发酵）采集酒醪样品；第17天、19～25天（醋酸发酵）采集醋醅样品；第27～31天（熏蒸阶段）采集熏醅样品。

NaOH、甲醇、冰醋酸、CHCl3、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙酸、乳酸、柠檬酸（均为优级纯）：美国Sigma公司；蒽酮（分析纯）：上海试剂一厂。

1.2 仪器与设备

Z-5000型原子吸收分光光度计：日本日立株式会社；AF-610B型原子荧光分光光度计：北京瑞丽仪器有限公司；L-8000型全自动氨基酸分析仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；Waters 2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司；HC-2062型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉酶、糖化酶和蛋白酶活力的测定

淀粉酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[10]，以1 g物料在40℃，pH 5.6的条件下，每1 min水解得到的还原糖的量为一个总淀粉酶活力单位（U/g）。糖化酶活力的测定参照GB8276—2006《食品添加剂糖化酶制剂》的方法进行[11]，并略有改动，以1 g物料在40℃，pH 4.6的条件下，每1 h水解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖为一个糖化酶活力单位（U/g）。蛋白酶活力的测定参照国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》中的福林比色法[12]，以1 g物料在40℃，pH 3.0或pH 7.2，每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为一个酸性或中性蛋白酶活力单位（U/g）。

1.3.2 理化指标的测定

水分含量的测定参照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》中的105℃恒质量法[13]；淀粉含量的测定参照GB/T 5514—2008《粮食、油料中淀粉含量测定》中酶水解法[14]；蛋白质含量的测定参照GB5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的自动凯氏定氮仪法[15]；脂肪含量的测定参照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中索氏抽提法[16]；总糖的测定采用蒽酮比色法[17]；还原糖、总酸、氨基酸态氮的测定分别参照GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》中的菲林试剂法[18]、GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》中的酸碱滴定法[19]和GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》的甲醛滴定法[20]进行；酒精度的测定采用酒精计法。

1.3.3 游离氨基酸的测定

游离氨基酸的测定参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》的方法进行[21]。酒醪、醋醅和熏醅样品经蒸馏水浸提后，过滤得到的溶液定容至250 mL，作为待测液。取1 mL待测液用6 mol/L的HCl稀释一倍，过0.45 μm滤膜后，用于氨基酸自动分析仪测定样品中的氨基酸含量。

1.3.4 有机酸的分析

有机酸的测定采用GB/T 5009.157—2003《食品中有机酸的测定》中的高效液相色谱法[22]。色谱条件：Spursil C18-EP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 2.5）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 μL；检测器：紫外检测器，检测波长210 nm。

2 结果与分析

2.1 发酵阶段淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力变化

淀粉酶、糖化酶和蛋白酶是参与谷物食醋酿造的主要酶类，本实验对酒精和醋酸发酵过程中这几种酶的活力进行了检测，结果见图1。

图1 传统山西老陈醋发酵过程中淀粉酶、糖化酶和蛋白酶的活力变化曲线Fig.1 Variation curves of glucoamylase,amylase and protease activity during fermentation process of traditional Shanxi aged vinegar

由图1可知，山西老陈醋在传统工艺的酒精发酵（1～16 d）与醋酸发酵（17～25 d）过程中，淀粉酶和糖化酶的活力较高，最高分别为438.94 U/g和257.23 U/g，而酸性和中性蛋白酶活力较低，分别只有64.56 U/g和27.40 U/g。4种酶活在酒精和醋酸发酵阶段略有变化但基本稳定，且酒精发酵阶段的酶活明显高于醋酸发酵阶段，这与醋酸发酵阶段加入了麸皮和谷糠的稀释作用有关，也可能与此阶段大量产生醋酸有关。

2.2 发酵及熏蒸过程中的变化

对传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中水分、淀粉、总糖、还原糖、酒精度、总酸、氨基态氮等的变化进行了分析，结果见表1。

表1 传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中理化指标的分析Table 1 Analysis of physicochemical indexes during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar

由表1可知，在酒精发酵阶段（1～16 d），发酵醪水分含量基本稳定在80%左右，淀粉含量从64.05%降至32.91%（干质量），总糖含量从11.88%降至1.12%，还原糖含量从9.78%降至0.81%，而酒精度从1.3%vol上升至5.7%vol，总酸从1.17%上升至10.07%。在此阶段，主要是大曲中的酶系（图1）和酵母菌[23]起作用，淀粉被淀粉酶和糖化酶水解为单糖，单糖被酵母菌转化为酒精。同时，由于大曲是自然发酵而成，除酶和酵母菌外还含有其他微生物，如乳酸菌[23]，所以在酒精发酵阶段，部分糖和酒精可被乳酸菌和其他微生物转化为酸，所以总酸含量一直增加。此外，在此阶段，酸性蛋白酶的活力较强（图1），蛋白质水解为氨基酸，因此氨基酸态氮含量增加明显。而脂肪含量的增加的原因，可能是原料中结合态的脂肪和脂溶性色素等，在淀粉和蛋白质等大分子被分解后释放出来。

在醋酸发酵阶段（17～25 d），水分含量稳定在62%～63%，淀粉由35.10%下降至27.48%（干质量），总糖含量从2.28%增加至7.35%，还原糖含量从4.70%增加至8.54%，总酸在第22天达到最高，为10.23%。在此阶段，淀粉酶和糖化酶仍有一定活力（图1），可将淀粉继续水解为糖，但醋酸菌是该阶段的优势菌种，它能迅速氧化酒精生成乙酸，并降低pH值，抑制其它微生物生长，因此糖类物质被利用较少，含量均略有增加。酒精在醋酸菌作用下迅速转化为醋酸，至第22天已检测不到；对应地总酸含量在第22天达到最高不再增加。由于醋酸发酵阶段蛋白酶的活力很低（图1），所以蛋白质和氨基酸态氮含量变化很小。

熏蒸（27～31 d）是一个加热的过程，水分由于蒸发作用而明显降低（64.2%～57.2%）；淀粉由于加热和有机酸存在，由27.65%下降至18.88%（干质量）；因美拉德反应，还原糖和氨基酸含量分别由7.75%和0.41%下降至2.91%和0.28%；总糖略有减少，脂肪和蛋白质含量基本不变，总酸含量增加，但不明显。

2.3 发酵及熏蒸过程中氨基酸的变化

20种氨基酸在发酵及熏蒸过程中的含量变化见表2。

表2 传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中氨基酸含量的变化Table 2 Variation of amino acid contents during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar mg/100 g

续表2

由表2可知，在传统山西老陈醋的在酒精与醋酸发酵以及熏蒸过程中能检测到至少20种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，各种氨基酸含量的变化趋势大致可以归纳为：酒精发酵过程中有不同程度的增加，醋酸发酵过程中变化不大，熏蒸阶段有不同程度的降低。

结合图1的结果，在酒精发酵阶段氨基酸的增加主要是蛋白酶分解蛋白质产生的，所以除赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸外，其他氨基酸含量均有所增加。而赖氨酸、组氨酸和鸟氨酸含量减少，主要是这些氨基酸在高粱等谷物蛋白中总量较少[24]，同时参与微生物（如酵母菌）菌体生长代谢所致。在醋酸发酵过程中，蛋白酶活力降低，而氨基酸仍需参与微生物（如醋酸菌）菌体的生长代谢，因此，含量较高的氨基酸变化较小，含量较低的氨基酸（如赖氨酸）显著降低。在熏蒸过程中，由于氨基酸和还原糖的美拉德反应，因此，各种氨基酸的含量均有所降低。

2.4 发酵及熏蒸过程中有机酸的变化分析

酸味物质是食醋中的主要组成成分，有机酸是酸味的主要来源，其种类、含量及其相互比例与食醋的质量密切相关[25]。本实验采用师晶晶[5]建立的山西老陈醋中有机酸的分析方法，对传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、丙酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸进行了测定，结果如图2所示。

由图2可知，醋酸和乳酸是传统山西老陈醋生产过程中含量变化最大的两种有机酸。在酒精发酵过程中，乳酸是主要的有机酸，醋酸含量在酒精发酵初期也有所增加（见图2）。醋酸发酵前期，醋酸含量增加明显，后期（22～25 d）基本保持不变，从工艺改良的角度出发，醋酸发酵的时间可缩短到第22天，总发酵时间可缩短4 d。由于酒精发酵的4～16 d主要是厌氧发酵，因此乳酸菌能产生大量乳酸。这与吴佳佳[23]从山西老陈醋的发酵酒醪中分离到了很多乳酸菌，并随着酒精发酵时间延长，乳酸菌的种类增多的结果相吻合。在醋酸发酵阶段，由于麸皮、谷糠添加的稀释作用，在初期（17 d）醋酸和乳酸含量迅速降低，但由于醋酸菌的接入和通气量的增加，酒精转化成醋酸，使醋酸的含量快速上升，成为最主要的有机酸（见图2）。而在熏蒸阶段醋酸和乳酸的含量均略有升高。

图2 传统山西老陈醋发酵及熏蒸过程中有机酸的变化Fig.2 Variation of organic acids during fermentation and fumigation process of traditional Shanxi aged vinegar

酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸，在整个生产过程中，基本呈现先升高，后降低，再升高的趋势（见图2）。在醋酸发酵和熏蒸过程中，酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸的含量增加，这可能与微生物的发酵和熏蒸过程中水分的蒸发有关。丙酸在第3天时含量达到10.47 mg/g，随后降低；第17天向酒醪中添加麸皮和谷糠，丙酸含量明显升高，这可能是因为填充料带入了一部分丙酸造成的；但第19天其含量突然降低，具体原因仍需进一步探讨，在熏蒸过程中，丙酸的含量降低。图2的结果与表1中总酸的变化趋势一致。

3 结论

酒精发酵阶段，淀粉酶、糖化酶、酸性和中性蛋白酶的活力虽然呈现出高-低-高的趋势，但基本稳定。在山西老陈醋的传统工艺中，曲的用量非常大（高粱与大曲质量比为100∶62.5），大曲除了是微生物（霉菌、酵母菌、醋酸菌等）的载体外，也是酶制剂，曲中淀粉酶等水解酶迅速分解淀粉变成糖，总糖和还原糖也在酒精发酵阶段的第1天最高。所以酒精发酵阶段的水解酶主要来自大曲，后期酶活稍有升高，可能是霉菌等微生物生长产生的。在醋酸发酵阶段，由于添加了麸皮和谷糠，酒醪被稀释，同时醋酸菌发酵产酸，pH降低，酶活受到抑制，因此，各水解酶的活力均有所降低。

由于酵母等微生物生长代谢，总糖、还原糖含量在酒精发酵阶段不断降低；而在醋酸发酵阶段略有增加的原因，可能是在此阶段糖化酶和淀粉酶仍具有一定的活性，可继续水解淀粉产生寡糖和单糖，而醋酸菌等微生物较少利用它们；在熏蒸阶段又降低，由于还原糖和氨基酸在加热的情况下，易发生美拉德反应，消耗了糖类。酒精含量在酒精发酵的第1～11天上升，在酒精发酵后期（14～16 d）保持稳定，在醋酸发酵第4天时检测不出，酒精发酵的时间可缩短2 d。总酸含量从第1～22天增加，而从第23～31天其含量变化不明显。

氨基酸在酒精发酵过程中含量明显增加，此阶段蛋白酶的活力较强，能分解蛋白质产生小分子肽和游离氨基酸；氨基酸含量在醋酸发酵过程中变化较小，此阶段蛋白酶活力显著降低，能少量分解蛋白质生成氨基酸；熏蒸过程中氨基酸含量有不同程度的降低，由于氨基酸和还原糖在加热的条件下易发生美拉德反应，消耗了氨基酸。

醋酸是山西老陈醋中的主要成分，在醋酸发酵前期和熏蒸过程中含量明显增加，在醋酸发酵后期（22～25 d）基本保持不变，醋酸发酵的时间可缩短到第22天，总发酵时间可缩短6 d。乳酸主要在酒精发酵过程中产生，在醋酸发酵和熏蒸过程中变化较小。其他有机酸在发酵及熏蒸过程中含量较低，变化较小。

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Changes of common conventional components in traditional process of Shanxi aged vinegar during fermentation and fumigation

CHEN Tao1,GUI Qing1,2,GUO Junlu3,WANG Zhenggang3,CHEN Fusheng1,4*(1.College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;2.Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Science,Wenchang 571339,China;3.Shanxi Mature Vinegar Group Co.,Ltd.,Taiyuan 030013, China;4.Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Wuhan 430070,China)

The changes of amylase,glucoamylase,acid protease and neutral protease activities during traditional fermentation process of Shanxi aged vinegar were analyzed,and the change rules and formation mechanism of conventional compositions including starch,total sugar,alcohol content,total acid,organic acid and amino nitrogen acid and other conventional compositions during fermentation and fumigation process were discussed.The results showed that during alcoholic fermentation process,activities of 4 kinds of enzyme changed little.During acetic fermentation process,activities of 4 kinds of enzymes reduced.During fermentation and fumigation process,starch contents reduced from 64.05%to 18.88%.In alcoholic fermentation process,total sugar contents reduced from 11.88%to 1.12%;in acetic acid fermentation process,it increased from 2.28%to 7.35%,however,in fumigation process,it reduced from 7.13%to 5.89%.In alcoholic fermentation process,alcohol contents increased from 1.3%vol to 5.7%vol,but it almost decreased to 0 on the 22 d.From the 1st to the 22nd day,the contents of total acid increased from 1.17%to 10.23%;acetic acid contents increased obviously from 1.03 mg/g to 76.25 mg/g.In alcoholic fermentation process,the lactic acid contents increased from 1.94 mg/g to 60.60 mg/g, but it changed slightly after alcoholic fermentation.

Shanxi aged vinegar;traditional process;conventional compositions;analysis

TS264

0254-5071（2017）01-0039-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.008

2016-08-11

科技部国际科技合作与交流专项（2014DFG32380）；武汉市国际科技合作计划（2015030809020368）；华中农业大学自主科技创新基金项目（2662014PY034）

陈涛（1979-），男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：陈福生（1965-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术与安全。