Wnt信号通路组件在胃癌及慢性萎缩性胃炎中的表达分析*

闫 媛,庄 坤,张 欣，左利平，韩 坤，李 宁,侯 妮

1.西安市中心医院(西安 710004)，2.西安交通大学医学部分子生物学与遗传学系(西安710061)

Wnt信号通路组件在胃癌及慢性萎缩性胃炎中的表达分析*

闫 媛1,庄 坤1,张 欣1，左利平1，韩 坤1，李 宁1,侯 妮2

1.西安市中心医院(西安 710004)，2.西安交通大学医学部分子生物学与遗传学系(西安710061)

目的：探讨Wnt信号通路在胃癌发生发展中的作用。方法：采用免疫组化方法检测胃癌、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎组织Wnt2及β-catenin的表达并进行分析。结果：胃癌组织Wnt2表达显著高于癌旁组织和慢性萎缩性胃炎表达；癌旁组织Wnt2表达高于慢性萎缩性胃炎表达。癌旁组织及慢性萎缩性胃炎β-catenin均表达，胃癌组织β-catenin表达显著高于癌旁组织和慢性萎缩性胃炎。结论：Wnt2、β-catenin在胃癌中均高表达，β-catenin在慢性萎缩性胃炎表达明显，Wnt信号途径异常活化在胃癌的发生发展过程中有重要作用。

胃癌是危害人类健康的恶性肿瘤之一，全球胃癌的致死率位居所有肿瘤的第二位[1]。胃癌的恶性表型基本生物要素和演变过程，恶性增殖表型与胃癌转移的潜能存在密切联系。Wnt信号途径是一种对细胞增殖、分化具有重要调节作用的信号传导系统。Wnt蛋白和β-连锁蛋白(β-catenin)是Wnt信号传导通路的重要组成部分。β-catenin和T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增强因子(Lymphoid enhancer factor，LEF)家族成员是Wnt信号传导通路的关键调节因素。Wnt信号途径参与细胞信号启动、分子传递、靶基因转录、表达等多个重要环节，是一个由多种分子参与，相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系。 越来越多的研究发现，Wnt信号通路除了参与调控发育过程以外，与胃癌的发生发展也有密切的关系[2-3]。β-catenin 是Wnt信号途径的中心环节或信使。β-catenin 与TCF/LEF 形成复合物进入细胞核内后，Wnt途径的相关靶基因即可开始转录表达，这些靶基因包括细胞周期和凋亡相关基因、生长因子和粘附分子等。一旦这些基因的转录和表达失衡，则与肿瘤的发生发展密切相关[4-5]。通过观察胃癌、癌旁组织、慢性萎缩性胃炎Wnt2及β-catenin的表达明确Wnt信号通路在胃癌发生发展过程的作用。

材料和方法

1 实验材料 胃癌及癌旁组织取自西安市中心医院15例胃腺癌患者的手术切除标本；慢性萎缩性胃炎组织取自西安市中心医院胃镜及病理诊断为慢性萎缩性胃炎15例患者的胃粘膜组织，Wnt2抗体，β-catenin抗体均购自美国Santa公司。

2 方 法

2.1组织固定、包埋、切片：分别将胃癌，癌旁组织，慢性萎缩性胃炎组织4%多聚甲醛浸泡固定24 h后，双蒸水冲洗3次，50%乙醇冲洗2次，乙醇浓度梯度逐级脱水(70%乙醇1 d，80%乙醇过夜，95%乙醇3h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2 h。无水乙醇二甲苯(1∶1)内浸泡组织45 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各30 min。浸入58℃恒温二甲苯石蜡(1∶1)45 Mmin，石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共2.5h，石蜡Ⅲ包埋组织。切成4μm石蜡切片，在50℃温水中展开，用洁净的载玻片捞片，使组织切片平附于载玻片，室温过夜。

2.2 检测方法：取各组石蜡切片，恒温箱内60℃烤片20 min。二甲苯Ⅰ浸泡10 min，二甲苯Ⅱ浸泡10 min，无水乙醇浸泡5 min, 95%乙醇浸泡5 min, 80%乙醇浸泡5 min, 60%乙醇浸泡5 min, 双蒸水浸泡5 min；灭活内源性过氧化物酶，3%H2O2室温封闭10 min，PBS冲洗3次，微波炉中加热柠檬酸钠缓冲液沸腾，放入组织切片煮沸15 min，冷却至室温，蒸馏水冲洗3次，加入山羊血清，室温20 min，甩去多余液体。分别滴加Wnt2抗体(1∶50)，β-catenin抗体(1∶50)4℃过夜，PBS洗涤3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(SAP显色剂B)室温15 min，PBS洗涤3次，滴加链霉亲和素-过氧化物酶(SAP显色剂C)室温15 min，PBS洗涤3次；避光将DAB显色显色试剂盒中A、B、C各一滴加入1 ml蒸馏水中，混合均匀后滴加于切片，自来水冲洗终止显色。苏木素复染3 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗后依次在60%乙醇5 min, 80%乙醇5 min, 95%乙醇5 min, 无水乙醇5 min中脱水，二甲苯20 min共两次透明；中性树胶封片后，显微镜下观察。

2.3 统计学方法：采用SPSS 18.0统计学软件，两组间差异比较应用独立样本双侧t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

结 果

1 Wnt2表达 见图1。胃癌组织Wnt2表达显著高于癌旁组织、慢性萎缩性胃炎组织(P< 0.05)；癌旁组织Wnt2表达高于慢性萎缩性胃炎组织(P< 0.05)。

A:胃癌，B:癌旁组织，C:慢性萎缩性胃炎组织

图1 Wnt2在胃癌及慢性胃炎组织中的表达(100×)

2 β-catenin表达 见图2。胃癌组织β-catenin表达显著高于癌旁组织及慢性萎缩性胃炎组织(P< 0.05)；癌旁组织及慢性萎缩性胃炎β-catenin均高表达。

A:胃癌，B:癌旁组织，C:慢性萎缩性胃炎组织

讨 论

Wnt信号途径是一种对细胞增殖、分化具有重要调节作用的信号传导系统。参与细胞信号启动、分子传递、靶基因转录、表达等多个重要环节，是一个由多种分子参与，相互影响、相互制约和协同作用的复杂体系。Wnt2和β-catenin是Wnt信号传导通路的重要组成部分，正常状态下β- catenin通过其降解复合体生成与降解的动态平衡，维持细胞的生理状态。β- catenin 的降解复合体由APC (Adenomatouspolyposis coli)、Axin、GSK-3β(Glycogen synthase kinase3)、CK1等构成。各部分功能不同，GSK-3β使β-catenin 磷酸化，Axin 在β-catenin 降解复合体中起支架蛋白作用，β- catenin 降解复合体生成与降解处于一种动态平衡状态。病理状态下，当β- catenin降解复合体的降解途径被切断时，β-catenin在细胞质中积累，细胞内增多的β-catenin与作为转录调节因子的DNA结合蛋白TCF/LEF相互作用进入细胞核内, 与相应的DNA结合, 导致相应靶基因(如C-myc、cyclin D1、MMP-7等)的持续转录及表达。

本研究我们可见胃癌组织Wnt2表达显著高于癌旁组织和慢性萎缩性胃炎表达，癌旁组织Wnt2表达高于慢性萎缩性胃炎表达(图1)。癌旁组织及慢性萎缩性胃炎β-catenin均表达，胃癌组织β-catenin表达显著高于癌旁组织和慢性萎缩性胃炎(图2)。胃癌组织中Wnt2与β-catenin表达均显著升高，显示Wnt信号通路在胃癌中异常活化，Wnt信号途径的β-catenin通过 与TCF/LEF 形成复合物进入细胞核内后激活其相关靶基因，这些靶基因涉及与细胞周期和细胞凋亡密切相关的基因，以及生长因子和粘附分子等，而这些基因的转录和表达失衡与胃癌的发生发展密切相关。慢性萎缩性胃炎是导致胃癌的一个重要原因[6-7]，慢性萎缩性胃炎的β-catenin表达明显，提示慢性萎缩性胃炎时Wnt信号途径已出现异常活化，这也是慢性萎缩性胃炎导致胃癌发生的一个重要机制。Wnt信号途径异常活化在胃癌的发生发展过程中有起重要作用。

[1] 邹小农, 孙喜斌, 陈万青, 等. 2003-2007年中国胃癌发病与死亡情况分析[J].肿瘤, 2012,32:109-114.

[2] 李 康, 旦 增. Wnt/β-catenin信号与胃癌防治研究进展[J].南方医科大学学报,2014,12:1852-1856.

[3] 刘晓红, 曹智新, 耿 明, 等. Wnt-5a基因在胃癌中的表达及意义[J].世界华人消化杂志,2010,18:1222-1226.

[4] 董稚明, 郭艳丽, 孙萍萍,等. 胃癌中Wnt信号通路的激活及E-cadherin/catenins的异常表达[J].河北医科大学学报,2008,29:652-656,652.

[5] Wu C, Zhuang Y, Jiang S,etal. Interaction between Wnt/beta-catenin pathway and microRNAs regulates epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer (Review) [J].Int J Oncol,2016,48:2236-2246.

[6] 王霄腾, 吕 宾. 胃癌前病变的风险评估[J].中华消化杂志,2016,36:208-210.

[7] Liu N, Zhou N, Chai N,etal. Helicobacter pylori promotes angiogenesis depending on Wnt/beta-catenin-mediated vascular endothelial growth factor via the cyclooxygenase-2 pathway in gastric cancer[J].BMC Cancer,2016,16:321.

(收稿：2016-11-12)

Analysis of Wnt signaling pathway activition in gastric carcinoma and chronic atrophic gastritis

Yan Yuan, Zhuang Kun, Zhang Xin,et al.

Xi’an Central Hospital (Xi’an 710004)

Objective: To explore the role of Wnt signaling pathway in the occurrence and development of gastric carcinoma. Methods: Using histochemistry to detected the expression of Wnt2 and β-catenin in gastric carcinoma, adjacent tissue, and chronic atrophic gastritis. Results: The expression of Wnt2 in gastric carcinoma is obviously more than adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. The expression of Wnt2 in adjacent tissue is more than chronic atrophic gastritis. There are expression of β-catenin in adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. The expression of β-catenin in gastric carcinoma is obviously more than adjacent tissue and chronic atrophic gastritis. Conclusion: Wnt2 and β-catenin are high expression in gastric carcinoma. β-catenin is expression in chronic atrophic gastritis. Abnomal Wnt signaling pathway is important in the occurrence and development of gastric carcinoma.

Gastric neoplasms Gastritis,atrophic @Wnt2 @β-catenin

* 陕西省自然科学基础研究计划项目(2014JN141160)

胃肿瘤 胃炎，萎缩性 @Wnt2 @β-连锁蛋白

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.007