EG00229对卵巢癌细胞增殖侵袭的作用及机制*

滕 月,贺 芳,张 键,张 燕△

1.西安交通大学第一附属医院妇产科(西安 710061)，西安交通大学第一附属医院转化医学中心 (西安 710061)

·基础研究·

EG00229对卵巢癌细胞增殖侵袭的作用及机制*

滕 月1,贺 芳2,张 键2,张 燕2△

1.西安交通大学第一附属医院妇产科(西安 710061)，西安交通大学第一附属医院转化医学中心 (西安 710061)

目的： 初步探讨EG00229对卵巢癌细胞侵袭、增殖的作用及其分子机制。 方法：采用铺Matrigel 基质胶Transwell实验检测细胞的侵袭能力；采用细胞计数方法检测细胞的增殖能力；采用Western blotting检测下游信号分子的表达变化。结果：EG00229显著抑制SKOV3卵巢癌细胞的侵袭、增殖，EG00229发挥作用的机制是通过抑制VEGFR2磷酸化和抑制ERK MAPK信号通路而抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭。结论：EG00229可以作为一个潜在的卵巢癌治疗药物。

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)发病率占全部女性生殖道恶性肿瘤的四分之一，同时也是恶性程度和致死率最高的妇科肿瘤[1-2]。虽然近年来卵巢癌的诊断和治疗技术有了明显的提高,但其5年生存率仍低于30%，目前肿瘤转移已经成为导致卵巢癌病例死亡的主要原因之一[3-4]。Nrp1是一种单次跨膜受体,起初在非洲爪蟾神经系统中发现[5-6 ]。Nrp1识别的配体是semaphorin 3和VEGF[7],在多种类型的肿瘤中发挥重要作用。据报道,Nrp1参与自分泌VEGF165依赖的信号途径促进乳腺癌转移[8]；Nrp1促进肺癌细胞和肾癌细胞发生增殖、迁移、侵袭[9]；Nrp1还促进人脑胶质瘤干细胞样细胞的增殖、侵袭[10]。以上研究结果提示Nrp1可能是一个卵巢癌有效的治疗靶点。EG00229是David研究小组设计并开发的针对Nrp1的特异性抑制剂[11]。EG00229可以与Nrp1 b1结构域末端的loops结合,封闭Nrp1的VEGF165结合位点,阻断Nrp1与VEGF的结合。EG00229可以同时靶向于血管生成和肿瘤生长转移,可能作为一个有效的候选卵巢癌治疗策略。在本研究中,我们试图初步研究EG00229对于卵巢癌细胞增殖、侵袭的作用。

材料与方法

1 材 料 卵巢癌细胞系SKOV3为本实验室保存；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；EG00229购自美国MCE公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Western blot发光底物Super Signal Fem to Substrate Kit购自美国Pierce公司；兔抗Nrp1抗体、兔抗VEGFR2、兔抗P-VEGFR2购自美国Abcam公司。

2 方 法 ①细胞培养：SKOV3细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件为37 ℃、5% CO2，每隔2 d传代1次为对照组。EG00229处理组中细胞培养液中加入终浓度为20 μmol/L的 EG00229,其他培养条件同对照组。②细胞侵袭实验：将冻存于-80℃的Matrigel基质胶置于4 ℃过夜液化,用无血清培养基以1∶5的比例进行稀释(以上操作均在4 ℃冰上进行)。Transwell置于24孔板中,上室加500 μl Matrigel稀释液,置于37 ℃培养箱中孵育2 h直至Matrigel固化。消化细胞后计数,每室加3×105个细胞,下室加800 μl 20%胎牛血清DMEM培养基,37 ℃培养48 h。取出Transwell小室,PBS清洗2遍后,用棉签小心擦去内室细胞,5%戊二醛固定10 min,姬姆萨染料染色30 min。倒置显微镜下观察小室外侧细胞,每个样本随机计数10个视野取平均值。③细胞增殖实验：将对照细胞和EG00229处理细胞分别种入96孔板中,每孔5×103个,设5个复孔。每隔24 h消化细胞,用Countess细胞计数仪计数,连续计数5 d。④Western blotting：细胞经PBS漂洗后加入预冷的细胞裂解液,用细胞刮刀将细胞刮下来,冰浴30 min让细胞充分裂解,离心后取上清。BCA法定量后进行SDS-PAGE,结束后将胶从电泳槽取出,与NC膜一起放在转移缓冲液浸泡10 min,按顺序将滤纸、胶、NC膜放入转移夹子中安装入槽,转移3 h后取出NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,用适当比例Nrp一抗或GAPDH一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次后用适当比例二抗室温孵育1 h,洗膜3次后化学发光。

3 统计学方法 实验数据以均值±标准差表示,采用GraphPad软件进行t检验分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1 Nrp1促进SKOV3卵巢癌细胞侵袭 见图1。过表达Nrp1的SKOV3细胞的小室外侧细胞数目明显多于对照细胞，随机取10个视野进行定量分析，过表达Nrp1细胞的数目约是对照细胞的4.5倍，约增多了3.5倍，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明：与对照SKOV3细胞相比，过表达Nrp1的SKOV3细胞的侵袭能力明显增强，Nrp1促进SKOV3卵巢癌细胞侵袭。

图1 不同Nrp1表达水平的SKOV3卵巢癌细胞侵袭能力比较(姬姆萨染色×20倍)

2 EG00229抑制SKOV3卵巢癌细胞侵袭 见图2。明确了Nrp1的作用后，我们采用Nrp1的特异性抑制剂EG00229处理SKOV3，通过EG00229封闭Nrp1的功能，然后利用细胞侵袭实验比较对照细胞与经EG00229处理的SKOV3细胞的侵袭能力的差异。处理组细胞的培养基中添加了20 μmol/L的 EG00229(上、下室均添加，其他条件同前)，48 h后倒置显微镜下观察小室外侧细胞数目。经EG00229处理的SKOV3细胞的小室外侧细胞数目明显少于对照细胞，随机取10个视野进行定量分析，EG00229处理细胞的数目约是对照细胞的1/3，约减少了60%，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明：与对照细胞相比，EG00229处理细胞的侵袭能力明显降低，EG00229抑制SKOV3卵巢癌细胞侵袭。

图2 对照组与EG00229处理组SKOV3卵巢癌细胞侵袭能力比较(姬姆萨染色×20倍)

3 EG00229抑制SKOV3卵巢癌细胞增殖 见图3。为了检测EG00229对卵巢癌细胞增殖能力的影响，我们用EG00229处理细胞(培养基中添加了20 μmol/L的 EG00229，每2 d换液一次,其他条件同前)，对培养不同天数的细胞分别进行了计数，通过细胞数目评价细胞增殖能力。与未经任何处理的SKOV3对照细胞相比，经EG00229处理的SKOV3卵巢癌细胞的细胞数目在第2天时便有所减少，第3天及以后约减少50%左右，差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明：与对照细胞相比，EG00229处理细胞的增殖能力明显降低，EG00229抑制SKOV3卵巢癌细胞增殖。

图3 对照组与EG00229处理组SKOV3卵巢癌细胞增殖能力比较

4 EG00229抑制VEGF下游活化信号 见图4。EG00229的作用原理是封闭Nrp1 b1结构域，使其不能与配体VEGF结合，进而影响VEGF(血管内皮生长因子)下游信号通路。因此我们检测了不同处理组细胞VEGFR和ERK MAPK的磷酸化，检测EG00229处理对其的影响。与未经任何处理的SKOV3对照细胞相比，经EG00229处理的SKOV3卵巢癌细胞的VEGFR2的磷酸化明显下降，ERK MAPK的磷酸化也明显下降，而其蛋白总量维持不变。以上结果表明： EG00229可能通过抑制抑制VEGFR2和ERK MAPK的磷酸化来抑制SKOV3卵巢癌细胞的增殖和侵袭。

图4 对照组与EG00229处理组SKOV3卵巢癌细胞相关分子表达情况

讨 论

Nrp1是一种多功能单次跨膜受体，参与调控神经细胞导向和轴突生长[5]、内皮细胞活化增殖和迁移[5]。近期研究发现,Nrp1介导独立的信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中起关键作用[8-10]。Nrp1既分布于肿瘤血管内皮细胞上,也直接分布于肿瘤细胞上,在这两个部位分别发生作用[6]。 因此，以Nrp1为靶点设计的小分子药物能更好的发挥抑制肿瘤的作用。

Nrp1的胞外结构区含900多氨基酸残基,由5个模块化结构域组成,分别是a1、a2、b1、b2和c结构域[5]。b1和b2结构域同源于凝血因子FV和FVIII的c1和c2盘状结构域，是VEGF的结合结构域[5]。根据b1结构域的X-线晶体结构信息,David课题组利用VEGF165的C末端短肽的结构为起始点设计发现了一种小分子EG00229，它能阻止VEGFA-Nrp1结合，降低肺癌细胞A549的生存能力，还能增加细胞毒药物(如5-氟尿嘧啶、紫杉醇、顺铂)对肿瘤细胞的杀伤效力[11]。但EG00229对卵巢癌细胞的作用尚未见到报道。

在本研究中，我们初步探索了EG00229对于卵巢癌细胞SKOV3的增殖、侵袭的作用，发现EG00229可以有效的抑制SKOV3细胞的增殖和侵袭，且通过抑制VEGFR2的磷酸化和ERK MAPK的活化发挥作用。本研究明确了Nrp1特异性抑制剂EG00229对于卵巢癌的抑制作用，初步揭示了EG00229作为临床上治疗卵巢癌候选药物的可行性。

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(收稿：2016-07-01)

The effects and mechanism of EG00229 on the proliferation and invasion of ovarian cancer cells

Teng Yue,He Fang,Zhang Jian,et al.

Department of Obstetrics and Gynecology,The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Objective: To investigate the effects and mechanism of EG00229 on the proliferation and invasion of ovarian cancer cells. Methods: Transwell assays were employed to examine the invasion abilities of ovarian cancer cells. Cell number counting assays were performed to detect the cell proliferation. Western blotting was performed to detect the expression of downstream signaling molecules. Results: EG00229 significantly inhibited the proliferation and invasion of SKOV3 cells via suppressing the phosphorylation of VEGFR2 and activation of ERK MAPK.Conclusion: EG00229 can be exploited as a potential drug in the treatment of ovarian cancer.

Ovarian neoplasms Cell proliferation Gene expression regulation, neoplastic @EG00229

*国家自然科学基金资助项目(81670806，81300716) 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20120201120089)

陕西省卫生厅科研基金项目(2012D59)

卵巢肿瘤 细胞增殖 基因表达调控,肿瘤 @EG00229

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.001

△通讯作者