姜黄素对H2O2>诱导人黑素细胞氧化应激损伤的预保护作用

董 妍,曾维惠△,李文彬

1.西安交通大学第二附属医院(西安 710004)，2.陕西省中医医院(西安 710003)

△通讯作者

姜黄素对H2O2>诱导人黑素细胞氧化应激损伤的预保护作用

董 妍1,曾维惠1△,李文彬2

1.西安交通大学第二附属医院(西安 710004)，2.陕西省中医医院(西安 710003)

目的：探讨姜黄素激活Nrf2对人黑素细胞免受H2O2诱导氧化应激损伤的预保护作用。方法：利用不同浓度的H2O2(50、100、200 μmol/L)处理人黑素细胞24 h,MTT检测细胞活性,筛选H2O2体外诱导人黑素细胞氧化应激的最适浓度；进一步使用10 μmol/L的姜黄素预处理细胞2 h后,使用最适浓度H2O2刺激24 h。MTT检测细胞活性,DCFH-DA流式检测细胞内活性氧(ROS)含量，Real-time PCR测定Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表达水平，Western blot检测Nrf2蛋白表达。结果：100 μmol/L的H2O2处理人黑素细胞24 h后细胞活性显著降低,10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后,人黑素细胞活性显著增强,流式检测结果显示细胞内ROS含量显著降低，Western blot检测结果显示Nrf2蛋白表达增加,Real-time PCR结果提示Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat的mRNA表达水平显著增强。结论：姜黄素保护人黑素细胞免受H2O2诱导氧化应激损伤的过程中激活了Nrf2信号通路,提示Nrf2是白癜风氧化应激致病机制中的关键分子,为临床治疗白癜风提供了一种思路。

白癜风是临床上常见的一种自身免疫相关性皮肤病,其发病率呈逐年上升的趋势,约占人群的1%～2%,好发于5～30岁儿童和青年。由于色素细胞受损导致色素脱失使白癜风患者皮肤防御外界损伤的能力显著下降，进一步引发其他皮肤疾病,甚至皮肤癌,严重影响患者身心健康。白癜风的病因复杂,其确切的发病机制尚不清楚,临床也缺少有效的治疗药物[1]。目前,多种机制被报道参与白癜风的发病过程,如自身免疫学说、黑素细胞自毁学说、遗传学说、神经化学因子学说等[2]。越来越多的证据提示氧化应激在诱发黑素细胞破坏或功能障碍方面可能发挥关键作用[3]。氧化应激过程中产生大量的氧自由基攻击细胞,特别是白癜风患者的黑素细胞更易于受到损伤,其正常代谢、增殖和分化受到干扰,并可能进一步诱发机体自身免疫反应,形成瀑布式效应,最终造成黑素细胞不可逆性损伤。因此,阐明白癜风患者黑素细胞易受到氧化损伤的具体分子机制,对指导临床治疗均具有重要的意义。姜黄素是从姜科植物的根茎中获得的一种天然化合物,具有抑制蛋白质的氧化及脂质的过氧化等抗氧化作用。本研究旨在探讨姜黄素对人黑素细胞免受H2O2诱导氧化应激损伤的预保护作用,从转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)信号通路切入,阐明其中可能的氧化应激机制。

材料与方法

1 主要试剂和仪器 M254基础培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、DCFH-DA、双抗(青霉素和链霉素)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、姜黄素购自美国Sigma公司；Nrf2、β-actin购自美国Abcam公司；Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat引物由上海生工合成。Real-time PCR试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix、八联管购自大连宝生公司；流式细胞仪(美国BD公司)。

2 方 法 ①细胞培养和传代：正常人黑素细胞由第四军医大学口腔医院组织工程中心惠赠。细胞复苏成功后,每2天换液一次，待细胞生长至培养瓶瓶底80%～90%时，给与传代。传代时弃去旧培养液，向培养瓶中加入37 ℃预温的0.25%胰酶消化液2 ml,轻摇使消化液流遍细胞表面,弃液，加入0.25%胰酶消化液0.5 ml，2～5 min后，在倒置显微镜下观察，如发现细胞皱缩变圆、散开漂浮，则加入培养液终止消化，反复吹打瓶底，使细胞悬浮，将细胞悬液加入另外的培养瓶中,每瓶加10 ml培养液，以1∶3传代。置于37 ℃,5%CO2及饱和湿度细胞培养箱内继续培养。②MTT法检测细胞增殖：将人黑素细胞以密度5000个/孔接种于96孔培养板,置于37 ℃,5%CO2培养箱培养24 h后加入不同浓度H2O2：50、100、200 μmol/L，筛选最适浓度的H2O2；进一步使用10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后,使用最适H2O2刺激24 h。同时,设置空白对照组。每组6个复孔,10 μg/ml的MTT 37 ℃孵育4 h,小心吸取液体,每孔加入200 μl的DMSO,小心振荡10 min，酶标仪492 nm波长下检测吸光值(A值)。③实验分组：实验分为四组，H2O2组；姜黄素组,姜黄素浓度为10 μmol/L；姜黄素+H2O2组,10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后使用最适H2O2刺激24 h；对照组,正常培养基。每组3个复孔，实验重复3次。④DCFH-DA流式检测：将人黑素细胞以1.5×105个/孔的密度接种于6孔培养板置于37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h后加入药物，分组同前，继续培养24 h，镜下观察细胞融合达到70%。小心吸取培养液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min。弃去PBS后，每孔加入2 ml浓度为10 μmol/L的DCFH-DA(无血清培养基配置)，置于细胞培养箱内避光孵育1 h。使用无血清培养基洗涤细胞3次,每次3 min。加入1 ml的0.25%胰酶约3 min，镜下观察细胞变圆,加入1 ml的含血清培养基终止细胞消化，轻轻吹打细胞，暗环境下收集细胞悬液，1000 r/min离心机4 ℃离心10 min,弃上清，加入1 ml的无血清培养基重悬制备成单细胞悬液，使用488 nm激发波长，525 nm发射波长流式检测各组细胞荧光强度。⑤Western blot检测：细胞给药刺激48 h后收集,每组3个复孔。每孔加入100 μl的RIPA裂解液,收集细胞后4 ℃离心机1000 r/min离心30 min,取上清。BCA试剂盒定量蛋白浓度后加入5×蛋白上样缓冲液，充分混匀后100 ℃变性10 min。每样本取25 μg,SDS-PAGE电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)电泳约90 min,取PVDF膜置于10%脱脂牛奶中封闭非特异性抗原2 h,加入一抗Nrf2(1∶500)或β-actin(1∶1000)过夜,TBST洗脱3次,每次15 min。加入二抗(1∶1000)室温避光孵育2 h,TBST洗脱两次,每次15 min,最后一次使用TBS洗膜一次，15 min。暗室内ECL试剂盒显影、曝光,以Nrt2与β-actin条带吸光度扫描灰度值的比值反应目的蛋白Nrf2蛋白表达水平。⑥Real-time PCR检测 ：使用Trizol法提取细胞总RNA,经Nanodrop 2000检测RNA含量及其纯度，260/A280比值均介于1.9～2.1,代表所提取RNA浓度较纯。Invitrgen逆转录试剂盒合成细胞cDNA，以其为模板进行Real-time PCR反应,引物序列由上海生工合成。Nrf2上游引物：5‘- TCAGCCAGCCCAGCACATCC-3’，下游引物：5‘- TCTGCGCCAAAAGCTGCATGC-3’；血红素氧合酶-1(Ho-1)上游引物：5‘-GAGTCTAGAATGCAGGCATGCTGGCTCCC-3’，下游引物：5‘-GAGTCTAGACAAGCTACTATCAGACAATGC-3’。过氧化物歧化酶1(Sod1)上游引物：5‘-CCGATGTGTCTATTGAAGATTCTG-3’，下游引物：5‘-TTTCCACCTTTGCCCAAGTC-3’；过氧化氢酶(Cat)上游引物：5‘-TGAGGTTGAACAGATAGC-3’,下游引物：5‘- CACAGGTATATGAAGATAATTG-3’。PCR反应体系为SYBR Green PCR Mix 10 μl,上下游引物各1 μl,cDNA模板2 μl,RNase-free ddH2O 6 μl；PCR反应条件：94 ℃预变性5 min后,进行循环，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min扩增,共35个循环，72 ℃延伸10 min。

结 果

1 MTT检测细胞活性 给予50、100、200 μmol/L的H2O2处理24 h后,人黑素细胞的活力呈剂量依赖性降低(P<0.05)，选择100 μmol/L浓度的H2O2为最佳刺激浓度(见图1)。当使用10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后,可以显著缓解H2O2引起的损伤作用,恢复细胞活力(见图2)。

图1 MTT检测不同浓度H2O2对人黑素细胞增殖活性的影响

图2 MTT检测10 μmol/L的姜黄素对人黑素细胞增殖活性的影响

2 姜黄素对人黑素细胞内ROS含量的影响 见图3。与对照组相比,H2O2损伤组细胞内DCF荧光强度显著增加(P<0.05)。10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后能明显降低细胞内DCF荧光强度(P<0.05)。

图3 姜黄素对人黑素细胞ROS含量的影响

3 姜黄素对Nrf2蛋白表达的影响 见图4。与对照组相比,H2O2损伤组细胞内Nrf2蛋白的表达强度降低。而10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后，姜黄素能显著增加细胞内Nrf2蛋白的表达强度。

4 姜黄素对Nrf2下游抗氧化基因表达的影响 见图5。与对照组相比，H2O2损伤组细胞内Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表达显著降低(P<0.05)。10 μmol/L的姜黄素预处理2 h后能显著增加细胞内Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因的表达(P<0.05)。

图4 姜黄素对人黑素细胞Nrf2蛋白表达的影响

图5 姜黄素对人黑素细胞Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat基因表达的影响

讨 论

大量研究报道氧化应激参与白癜风的发展，而且与其病情的活动性也具相关性，甚至有专家认为ROS可作为白癜风病情活动性的指标[4]。黑素细胞在合成黑素过程中产生大量ROS[5]，ROS增加黑素合成中间毒性产物，使得儿茶酚胺释放增多，从而引起黑素细胞免疫性损伤[6]。此外，ROS可直接攻击黑素细胞，诱导细胞凋亡，产生新的自身抗原或者释放隐蔽抗原，破坏细胞免疫耐受，进一步引发免疫反应。H2O2为首的ROS可以自由穿过各种细胞膜，灭活多种抗氧化酶，包括谷胱甘肽S转移酶、过氧化氢酶及乙酰胆碱酯酶，引起脂质过氧化，对细胞危害较大。临床研究报道，在进展期白癜风患者表皮中检测到H2O2浓度高达10-3mol/L，高于其生理浓度 (10-7～10-6mol/L)，该研究为氧化应激参与白癜风发病提供了最直接的证据[4]。本研究使用不同浓度的H2O2刺激人黑素细胞体外构建氧化应激模型，通过MTT检测，最终选择100 μmol/L的H2O2为最适刺激浓度，为本研究提供了良好的细胞模型基础。

近年来，外源性提高皮肤细胞抗氧化能力，降低细胞氧化损伤成为减轻白癜风发生的治疗方向。因此，具有抗氧化作用的抗氧化物是研究白癜风治疗方法的热点之一。Tuula 等[7]研究提示银杏叶提取物中的银杏内酯和银杏糖苷B、C、J及M具有抗氧化功能。槲皮素和绿茶提取物对 H2O2诱导的Mel-Ab细胞损伤具有保护作用，且两者具有协同抗氧化作用[8]。Becatti 等[9]研究发现，辣椒辣素可抑制细胞内 ROS 的产生,提高细胞抗氧化能力，降低脂质过氧化水平，抑制 Caspase 级联反应，从而延缓白癜风进程。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗氧化效应[10]。本研究使用MTT法观察姜黄素对100 μmol/L的H2O2诱导细胞凋亡保护效应，结果显示10 μmol/L姜黄素预处理后,OD值显著增加,提示姜黄素可以增强人黑素细胞的增殖活力。DCFH-DA法是常用的检测细胞内ROS含量的方法,其基本原理是DCFH-DA穿过细胞膜进入细胞内,与细胞内ROS反应转变为有荧光的DCF,进一步通过仪器接受其荧光信号。本研究结果显示随着H2O2浓度的增加,DCF强度越大,当10 μmol/L姜黄素预保护2 h时,DCF强度降低。结果提示,H2O2刺激人黑素细胞抑制细胞增殖,10 μmol/L姜黄素可减缓H2O2的抑制效应,这一途径可能是通过抑制ROS产生或加快ROS清除实现的。

皮肤暴露在物理、化学等环境下，催化产生ROS，皮肤细胞启动抗氧化机制抑制ROS的过量生成，从而维持细胞内环境的稳定。Nrf2/KEAP1信号通路是细胞内重要的内源性抗氧化防御信号通路，在细胞抗氧化防御中发挥关键作用。Nrf2是一种含有亮氨酸拉链基本结构的转录因子，属于Cap-n-Colla(rCNC)调节蛋白家族，广泛表达于各种细胞中，如肝脏、肾脏、皮肤、肺及消化道等[11]。Nrf2可与胞核内的抗氧化反应元件(ARE)的DNA序列结合，调控下游一系列II相解毒酶和抗氧化蛋白/酶的表达。在静息状态下，Nrf2与胞浆内Keap1相结合铆钉在胞浆中，通过泛素蛋白酶体途径降解[12]。当细胞遭受一定强度的外界氧化应激刺激时，Nrf2与Keap1解偶联并转移入核,与核内的ARE结合,启动Ho-1、Sod1、Cat等一系列II相解毒酶和抗氧化基因的表达,维持细胞内氧化-抗氧化平衡。然而,当外界强度过大，超出细胞内源性抗氧化系统清除ROS能力时，打破氧化-抗氧化平衡,最终引起细胞损伤。本研究结果显示10 μmol/L的姜黄素预处理细胞2 h，Nrf2的表达量显著升高，此外，下游抗氧化基因Ho-1、Sod1、Cat的mRNA水平都显著升高。结果提示，H2O2刺激人黑素细胞抑制Nrf2/KEAP1信号通路,10 μmol/L的姜黄素可通过上调Nrf2蛋白及其下游基因表达，从而启动Nrf2/KEAP1信号通路，保护细胞正常生理功能。

至今,白癜风并没有完全治愈的特效方法，氧化应激作为参与白癜风发病的重要因素，通过外源性增加抗氧化剂，防止细胞内ROS的过度产生，对稳定病情有重要意义。本研究证实姜黄素对H2O2诱导人黑素细胞损伤具有保护效应，通过抗氧化作用实现，我们推测Nrf2/KEAP1信号通路在保护人黑素细胞抵抗外界氧化损伤中发挥重要作用。此外，白癜风患者的黑素细胞中Nrf2/KEAP1信号通路也可能存在异常，使得其对氧化应激较为敏感。随着研究的不断深入，对姜黄素如何激活Nrf2/KEAP1信号通路的进一步了解，将有助于更加全面理解姜黄素在人黑素细胞氧化还原平衡维持与调节中的作用，为白癜风抗氧化防治提供新思路。

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(收稿：2016-08-01)

Curcumin preprotect human melanocytes from oxidative stress induced by H2O2

Dong Yan,Zeng Weihui,Li Wenbin.

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Objective: To investigate the protective effects of curcumin on human melanocytes against oxidative stress induced by H2O2through activation of Nrf2. Methods: 24 h treatment with different concentrations of H2O2(50, 100, 200 μmol/L) on human melanoma cells to select the optimum in vitro induction concentration of H2O2. Moreover, the optimum H2O2stimulation of 24 h was used under the pretreatment with 10 μmol/L curcumin for 2 h. MTT was used to detect the cell viability; intracellular reactive oxygen species(ROS) content was tested by flow cytometry; the expressions of Nrf2、Ho-1、Sod1、Cat mRNA were detected using Real-time PCR; Western blot was used to test the expression of NRF2. Results: Cell viability decreased significantly after treatment of 100 μmol/L H2O2for 24 h, while strengthened significantly after 10 μmol/L curcumin pretreatment for 2 h. The intracellular ROS content decreased significantly by detection of flow cytometry. Nrf2 increased by detection of Western blot. The Real-time PCR results suggest that Nrf2, Ho-1, Sod1 and Cat mRNA were significantly improved. Conclusion：Curcumin protect human melanoma cells against H2O2induced oxidative stress damage through activation of the Nrf2 signaling pathway. Nrf2 is suggested to be the key molecules in the pathogenesis of vitiligo oxidative stress, which provide a method to the treatment of vitiligo.

Curcumin Melanocytes Oxidative stress NF-E2-related factor 2

姜黄素 黑素细胞 氧化性应激 NF-E2相关因子2

R758.41

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.006