RhoGDI2在结直肠癌中的表达及临床意义①

柳思琪 马俐君 颜宏利 王文睿 金珍婧

(吉林大学第二医院，长春130021)

RhoGDI2在结直肠癌中的表达及临床意义①

柳思琪 马俐君②颜宏利③王文睿 金珍婧

(吉林大学第二医院，长春130021)

目的：探讨RhoGDI2在结直肠癌中表达及临床意义。方法：通过免疫组化检测 RhoGDI2 在结直肠癌组织、癌旁组织及转移淋巴结中表达，分析其与CRC患者临床因素及生存期之间的关系。结果：RhoGDI2在癌旁组织、肿瘤原发灶及转移淋巴结中表达逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.001)； RhoGDI2表达与淋巴结转移、远处转移关系密切(P<0.05)；高表达RhoGDI2者总生存期及无病生存期短。结论：RhoGDI2在结直肠癌组织中高表达，且与结直肠癌淋巴结转移、远处转移明显相关，高表达RhoGDI2者总生存期及无病生存期短。

RhoGDI2;结直肠癌;转移

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范围内人类最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈现上升趋势，对人类的生命构成严重威胁。CRC的侵袭及转移是其致死的主要原因，但明确的生物学机制尚不明确，CRC的5年生存率仍徘徊在50%左右[1,2]。

Rho鸟苷三磷酸酶(RhoGTPases)家族包括Rac1、RhoA和Cdc42，它调控着诸多的信号传导途径，尤其在细胞形态、迁移、黏附、细胞骨架重组、细胞周期及基因转录等方面发挥至关重要作用，更有研究证实部分肿瘤增殖及凋亡也受影响[3-5]。Rho鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子(RhoGDP dissociation inhibitor，Rho GDI)作为RhoGTPases活性的关键调节因子，在肿瘤发生发展及转移中发挥至关重要作用[6]，目前已有大量文献报道RhoGDI2在肺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等肿瘤中的意义，但其在CRC中发挥作用及机制研究甚少[7-10]。

本研究通过免疫组化方法RhoGDI2在CRC肿瘤原发灶、癌旁组织及转移淋巴结中的表达，进一步分析其与CRC患者临床病理指标的关系及对总生存期和无病生存期的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本及临床资料 本研究从吉林大学第一医院病理科严格选取2006年6月至2012年11月期间行结直肠癌根治术患者手术切除的原发灶组织石蜡标本共计87例，其中男性54例，女性33例，年龄28～88岁，中位年龄60岁，结直肠癌TNM分期按 AJCC2010第七版标准,其中Ⅰ期19例,Ⅱ期21例,Ⅲ期22例,Ⅳ期25例。所有患者自术后起均通过电话随访至死亡或存活满5年。并选取18例患者对应的癌旁组织石蜡切片和转移淋巴结组织石蜡切片，所有选择标本均经过HE染色及组织学确认，并由两位病理科医生共同诊断确定结果，全部病患术前均未行放化疗及靶向治疗。所有患者相应临床资料均经吉林大学第一医院伦理委员会同意后从吉林大学第一医院病案室或经随访获得。

1.1.2 试剂 兔抗人RhoGDI2抗体购自美国Abcam公司，兔二抗购自上海威奥生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 脱蜡、水化：组织切片置于75℃烤箱内烘烤15 min；二甲苯切片浸泡15 min，共两次；100%无水乙醇浸泡2 min-100%乙醇再浸泡2 min-90%乙醇浸泡2 min-80%乙醇浸泡2 min-70%乙醇浸泡2 min；1×PBS清洗5 min×3次；封闭酶阻断剂：每张组织切片上滴加配置好的H2O2及甲醇混合液( H2O2：甲醇=1∶9)100 μl，室温条件下避光静置10 min；1×PBS清洗5 min×3次；抗原热修复：枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)高压修复10 min，自然冷却至室温：1×PBS清洗5 min×3次；封闭：10% BSA 37℃条件下封闭30 min；滴加抗体稀释液稀释的一抗50 μl，4℃孵育过夜；次日复温后1×PBS清洗5 min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的二抗50～100 μl，37℃孵育75 min；1×PBS清洗5 min×3次；DAB显色：滴加50 μl新鲜配制的DAB工作液，室温孵育，显微镜下观察以控制显色时间，自来水冲洗10 min；苏木素45 μl复染1 min；自来水洗1 min；盐酸酒精分化1 s；自来水洗1 min；稀氨水返蓝8 s；脱水、封片：80%乙醇30 s-90%乙醇30 s-100%乙醇1 min-100%乙醇2 min-二甲苯2 min二甲苯2 min，晾干后中性树胶封片；普通光学显微镜下观察。

1.2.2 免疫组织化学染色结果判读 ①RhoGDI2表达主要位于细胞浆内，在显微镜下观察到胞浆中出现棕黄色或者棕褐色颗粒为阳性；未观察到棕黄色或棕褐色颗粒者则为阴性。②评分标准：请3位病理科医生对切片进行镜检观察，3人对切片所对应患者病理资料不知情，且各自独立在普通光学显微镜阅片，在切片中随机挑选5个视野，根据切片中阳性细胞百分率和阳性细胞染色强度判断结果。其中阳性细胞染色强度评分标准:阴性为0分，淡棕色为1分，棕色为2分，深棕色为3分。阳性细胞百分率评分标准：0～5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。组织标本阳性等级评分=阳性细胞染色强度评分+阳性细胞百分率评分，0～2分为(-)，3分为(+)，4分为(++)，≥5分为(+++)。

1.3 统计学方法 分析采用χ2检验或 Fisher分析；原发灶、癌旁组织和转移淋巴结蛋白表达差异比较釆用χ2检验；利用Kaplan-Meier绘制生存曲线；所有数据均采用Graphpad Prism 6.0或SPSS21.0软件进行统计分析，以P<0.05定义为具有统计学差异，以P<0.01定义为具有显著统计学差异。

2 结果

2.1 RhoGDI2在结直肠癌、癌旁组织及转移淋巴结中表达水平 RhoGDI2在18例结直肠癌患者肿瘤原发灶、癌旁组织及转移淋巴结中阳性表达分别为6例、0例及12例，通过统计学方法比较RhoGDI2在转移淋巴结中阳性率明显高于肿瘤原发灶及癌旁组织。见表1、图1。

2.2 RhoGDI2表达与结直肠癌临床病理指标的关系 我们将RhoGDI2在87例结直肠癌患者的原发灶中表达水平与相应患者临床病理指标结合，通过χ2检验来统计它们之间的关系。见表2。

表1 RhoGDI2蛋白在结直肠癌、癌旁组织及转移淋巴结中的表达情况

Tab.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues

GroupsnPositivePositiveratePCRCtissues186333%<0001Para⁃tumorous1800Lymphnodes1812667%

图1 RhoGDI2蛋白在结直肠癌、癌旁组织及转移淋巴结中表达(SP，×200)Fig.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues(SP，×200)

表2 RhoGDI2 表达与临床病理指标关系

Tab.2 Relationship between RhoGDI2 expression and clinical factors

ClinicalfactorsnRhoGDI2expressionHighLowPn872364Age06828<60411031≥60461333Gender05227Male541341Female331023Size03562<5cm451035≥5cm421329Locationoftumor06427Colon611744Rectum26620Number03911Single852362Multiple202Differentiation05661High202Moderate471433Poor38929Stage00812I+Ⅱ40733Ⅲ+Ⅳ471631Lymphnodemetastasis003371)(+)441628(-)43736Remotemetastasis002841)(+)261115(-)611249Vascularinvasion04374(+)321022(-)551342Venousinvasion02003(+)321121(-)551243

Note：1)P<0.05.

2.3 RhoGDI2与结直肠癌总生存期及无病生存期关系 将RhoGDI2在87例结直肠癌患者中表达水平与结直肠癌总生存期及无病生存期关系通过Kaplan-Meier绘制生存曲线来统计，结果见图2、3。

图2 不同表达量的RhoGDI2与结直肠癌患者总生存期关系Fig.2 Relationship between different expression of RhoGDI2 with overall survival in patients with CRC

图3 不同表达量的RhoGDI2与结直肠癌患者无病生存期关系Fig.3 Relationship between different expression of RhoGDI2 with disease-free survival in patients with CRC

3 讨论

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率呈明显上升趋势，逐渐成为一种严重危害人类健康的恶性疾病。随着外科手术的进步、放化疗及靶向治疗的应用，结肠癌患者预后有所改善，但肿瘤复发、肿瘤转移仍是患者死亡的主要原因，且逐渐成为提高患者生存期及改善预后的主要屏障。因此，深入研究结直肠癌发生、发展机制，积极寻求对抗方法，对进一步改善患者预后、延长生存期有重大意义。

Rho蛋白家族属于Ras癌基因超家族，是一组相对分子质量约为20～30 kD的GTP结合蛋白，具有GTP酶活性，习惯上被称为Rho GTP酶，包括RhoA、Rac1、Cdc42[11]。

RhoGDIs与其他两个调节因子RhoGEFs和RhoGAPs不同(每一家族超过60成员)，只存在三种亚型： RhoGDI1或RhoGDIα、RhoGDI2或RhoGDIβ及RhoGDI3或RhoGDIγ，其中，RhoGDI1和RhoGDI3表达量较低，主要与高尔基体和囊泡功能相关，在肿瘤方面的作用知之甚少。RhoGDI2由201个氨基酸构成，分子量为27 kD，是RhoGDIs中表达最高的，最初认为其仅特异性地表达在淋巴造血组织，参与调节淋巴细胞的活化、存活及反应性。近年来的研究发现，RhoGDI2在许多恶性肿瘤组织中异常表达，与肿瘤的发生、发展及转移等密切相关。

RhoGDI2 在人体多种肿瘤组织中存在异常表达。Theodorescu等[12，13]研究表明，RhoGDI2在原发性膀胱癌中表达水平低甚至不表达，其表达水平和膀胱癌患者生存率呈正相关，并通过单因素及多因素分析证实其是膀胱癌患者预后评估的独立因子。RhoGDI2在乳腺癌发生发展中发挥双向调节作用，有研究指出乳腺增生病变区域RhoGDI2比乳腺正常上皮细胞表达量高，浸润型乳腺癌中RhoGDI2 的表达比乳腺原位癌中的低，另外RhoGDI2 的表达与淋巴结转移呈负相关[14，15]。RhoGDI2表达和胰腺癌的关系研究显示RhoGDI2在胰腺癌中表达升高，且受累神经节也可见RhoGDI2表达升高，siRNA RhoGDI2表达后可导致胰腺肿瘤细胞对神经侵袭能力改变[16]。Cho等[17]发现RhoGDI2在晚期胃癌组织中表达明显高于早期胃癌组织和正常胃黏膜，与胃癌淋巴结转移呈正相关。还有学者指出 RhoGDI2在高分化卵巢癌中的表达水平较高，其过表达与肿瘤病理类型有关，与肿瘤分期无关[8,18]。

本研究利用免疫组化检测RhoGDI2在不同结直肠癌组织中表达情况，以及在原发灶、癌旁组织、转移淋巴结等表达差异性，以研究RhoGDI2表达与结直肠癌发生及转移有无相关性，同时结合患者临床化验指标进行分析，以明确该其与患者预后关系。结果显示RhoGDI2蛋白在转移淋巴结、肿瘤原发灶、癌旁组织中表达逐渐降低，其表达与结直肠癌淋巴结转移、远处转移关系密切，与性别、年龄、肿瘤大小、位置、分期及分化程度等无关，高表达RhoGDI2的患者总生存期及无病生存期短，RhoGDI2的高表达与结直肠癌的发生、发展关系密切。

4 结论

RhoGDI2在结直肠癌组织中表达明显升高，其在转移淋巴结、原发灶、癌旁组织中表达量依次降低，RhoGDI2的表达与结直肠癌淋巴结转移、远处转移关系密切，与性别、年龄、肿瘤大小、数目、分期、分化程度、血管浸润及神经侵袭等无关，高表达RhoGDI2的患者总生存期及无病生存期短。

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[收稿2016-09-27]

(编辑 张晓舟)

RhoGDI2 expression and clinical significance in colorectal cancer

LIUSi-Qi,MALi-Jun,YANHong-Li,WANGWen-Rui,JINZhen-Jing.

TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To explore the expression and clinical significance of RhoGDI2 in colorectal cancer.Methods: Immunohistochemistry was used to identify RhoGDI2 expression in clinical samples of colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues.The relationships between CRC clinical factors and survival were analyzed.Results: RhoGDI2 expression contributed positively with tumor progression and metastasis in clinical tissues.It was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.Conclusion: RhoGDI2 showed high expression in colorectal cancer and it was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.

RhoGDI2;Colorectal cancer;Metastasis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.022

①本文受吉林省发展和改革委员会资助(2013C026-1)。

柳思琪(1988年-)，女，硕士，医师，主要从事慢性肝病、重症肝病的临床及基础研究。

及指导教师：金珍婧(1965年-)，女，博士，主任医师，主要从事消化道肿瘤、肝硬化的临床及基础研究，E-mail:jinyu0429@sina.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)01-0108-04

②上海交通大学医学院附属同仁医院，上海200336。

③第二军医大学附属长海医院，上海200433。