雷帕霉素对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

陈 洁 陈兴强 符薇薇

(三亚市人民医院肾内科，三亚572000)

雷帕霉素对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

陈 洁 陈兴强 符薇薇

(三亚市人民医院肾内科，三亚572000)

目的：评价雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响，探讨其在糖尿病肾病防治中的意义。方法：体外培养的大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1分为：正常对照组、高糖组、高糖加不同浓度的雷帕霉素组，应用CCK-8法观察细胞增殖的变化；流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况；Real-time PCR法检测各组细胞中血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)、转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果：高糖诱导下HBZY-1的增殖水平明显上升，凋亡水平下降，ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表达水平上升，而雷帕霉素具有明显抑制作用，且有剂量依赖性，并下调ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表达；对于细胞周期，高糖组的S期细胞明显高于正常组(P<0.05)；雷帕霉素干预后，S期细胞比例减少(P<0.05)。结论：雷帕霉素能够抑制高糖状态下HBZY-1的增殖，促进其凋亡及导致G1/S期阻滞，同时下调ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表达。

雷帕霉素；高糖；肾系膜细胞；增殖；凋亡；细胞周期

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是1型糖尿病和2型糖尿病最常见的微血管并发症之一，是导致终末期肾病的主要的病因之一[1]。DN的临床表现为蛋白尿增多和肾脏功能的逐渐下降，直至发展成为肾衰竭。关于DN的病因尚未完全明确，目前认为是在遗传背景下多因素共同参与的，如高血糖、高血压和肾脏的血流动力学异常等因素。长期的高糖环境可导致糖化末端产物的聚积、慢性炎症反应和促纤维化细胞因子如血管紧张素II(AngiotensinⅡ，ANGⅡ)，转化生长因子β1(Transfor ming growth factor beta1，TGF-β1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌增多[2]。DN的病理学表现为肾小球系膜细胞增殖、细胞因子大量分泌、细胞外的基质堆积和肾小球的硬化[3]。但是现阶段对DN仍缺乏有效的治疗方法，主要从控制发病因素如控制血糖、控制血压，对于发展到终末期的DN甚至需要肾脏移植。因此针对DN的发病机制，寻求新的积极有效的治疗措施迫在眉睫。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt通路下游的重要效应靶蛋白，对细胞生长、增殖和分化具有关键的调控作用[4]。雷帕霉素(Rapamycin)为mTOR的抑制剂，是吸水性链霉菌的代谢产物，在1975年首次被发现。后来被广泛用于抑制器官移植的排异反应和抗肿瘤治疗[5,6]。本文通过观察雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞的增殖、凋亡、细胞周期及肾系膜细胞分泌的细胞因子的影响，探讨雷帕霉素对治疗糖尿病肾病的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠系膜细胞HBZY-1购自酶联(上海)生物试剂科技有限公司；不完全Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)和胎牛血清购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自美国Invitrogene公司；逆转录试剂盒购于美国Promega公司；实验用药物mTOR抑制剂雷帕霉素为美国Sigma公司产品；Real-time PCR试剂(SYBR Green Master Mix)、CCK-8 Cell Counting Kit均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit购自美国BD Biosciences 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞株HBZY-1培养 HBZY-1常规培养于含10%胎牛血清的DMEM中，呈贴壁生长，培养条件 37℃，5%CO2。在培养液中加入以下不同的处理因素将细胞分为4组：正常对照组(NG)：5.6 mmol/L的葡萄糖；高糖组(HG)：20 mmol/L的葡萄糖；高糖+雷帕霉素组1(HG+R1)：20 mmol/L的葡萄糖和50 nmol/L的雷帕霉素；和高糖+雷帕霉素组2(HG+R2)：20 mmol/L的葡萄糖和100 nmol/L的雷帕霉素。

1.2.2 CCK-8细胞增殖实验 将4组不同处理的HBZY-1细胞以1 000个/孔细胞数接种于96孔板中，每组设5个复孔。分别在培养1、2、3、4和5 d后，按照CCK-8试剂盒说明书推荐的步骤检测细胞增殖情况，用全自动酶标读数仪检测OD值，波长为450 nm。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将四组不同处理的HBZY-1细胞以1×106个/孔细胞数接种于6孔板中，培养24 h后用PBS洗涤两次，1×Binding Buffer 重悬细胞。分别加入50 μl 以异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)和50 μl碘化丙啶(PI)，轻柔混匀，室温避光染色15 min后用流式细胞仪进行细胞凋亡的检测。

1.2.4 流式细胞术检测细胞生长周期 将HBZY-1饥饿24 h后，分别以3×105个/孔细胞数接种于6孔板中，用上述4种处理方式培养72 h后再用胰酶消化细胞，PBS洗涤2次，75%乙醇固定，PBS再次洗涤，加入1% Triton X-100 1 ml作用10 min，0.01% RNA酶1 ml处理10 min，最后以0.25%碘化丙啶(PI)染色20 min后用流式细胞仪进行细胞周期的分析。

1.2.5 Real-time PCR法检测mRNA水平 用Trizol收取上述4组不同处理的HBZY-1细胞，用氯仿抽提法得细胞RNA，经逆转录得cDNA，应用罗氏荧光定量PCR仪Lightcycler 480采用两步法进行定量检测实验，使用2-ΔΔCt法对结果进行相对定量分析。所用引物见表1。

2 结果

2.1 雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞增殖的影响 各组5个时间点所测OD450数据列于表2。整体地看，4个组间，5个时点间，以及分组与时间的交互作用，均有显著性意义(P<0.05)，两因素重复测量方差分析，提示均存在组间时点间差异，且各组OD450随时间的变化趋势不同。进行两两组间及两两时点间的比较，并结合主要数据来看：与正常组比较，高糖组在3 d后细胞的增殖水平明显上升(P<0.05)；而当在高糖培养的细胞中同时应用雷帕霉素后，相对于高糖组细胞的增殖能力受到抑制，且为剂量依赖性(P<0.05)，说明了雷帕霉素可显著抑制高糖刺激的细胞的增殖。详见表2。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

2.2 雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞凋亡水平的影响 各组早期凋亡率及总凋亡率检测资料列于表3中。经整体比较(单因素方差分析)：早期凋亡率及总凋亡率，4个组间整体差异均显著(P<0.05)。再进行两两组间比较，并结合主要结果来看：高糖处理组细胞的凋亡水平明显低于正常组(P<0.05)；而当用雷帕霉素处理后高糖组细胞的凋亡水平相对于高糖培养的细胞显著升高，且为剂量依赖性(P<0.05)，提示了雷帕霉素能够促进高糖诱导的肾系膜细胞的凋亡作用。详见表3。

2.3 雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞细胞周期的影响 经流式细胞术检测的细胞生长周期资料列于表3中。4个组整体比较，S-phase(%)数据差异有显著性意义(P<0.05)。再进行两两组间比较，并结合主要数据来看：高糖组细胞的S期比例明显高于正常组(P<0.001)，当用雷帕霉素干预后，与单纯高糖培养的细胞比较，干预组的S期细胞比例减少，并呈现剂量依赖的关系(P<0.001)，表明雷帕霉素能够一定程度促进细胞G1/S期的阻滞。详见表4。

2.4 雷帕霉素对高糖诱导的细胞因子影响 已知ANGⅡ、TGF-β1和VEGF在DM中是高表达的，因此我们通过Real-time PCR检测雷帕霉素对于细胞因子的表达水平的影响。结果列于表4中。整体比较发现：3个细胞因子，在4个组间的差异均具有显著性意义(P<0.05，单因素方差分析)。两两比较并结合主要数据来看：与正常组比较，高糖组能够明显促进ANGⅡ(P<0.001)、TGF-β1(P<0.01)和VEGF mRNA(P<0.001)的表达水平。而当用雷帕霉素处理后，ANGⅡ、TGF-β1和VEGF mRNA的表达水平明显下降(P<0.001)。该结果提示了雷帕霉素可以抑制高糖诱导的肾系膜细胞分泌ANGⅡ、TGF-β1和VEGF。详见表5。

表2 各组OD450数据的比较

Tab.2 Comparison of OD450 data in each group

表3 各组凋亡率数据的比较

Tab.3 Comparison of apoptosis rate data in each group

表4 各组S-phase数据的比较

Tab.4 Comparison of S-phase data in each group

GroupS⁃phase(%)NG6189±27HG6348±60HG+R16192±24HG+R26175±27HolisticanalysisF，P28547，0000HGvsNGLSD⁃t，P7344，0000HG+R1vsNGLSD⁃t，P0134，0894HG+R2vsNGLSD⁃t，P0671，0510HG+R1vsHGLSD⁃t，P7210，0000HG+R2vsHGLSD⁃t，P8015，0000HG+R2vsHG+R1LSD⁃t，P0805，0430

表5 3种细胞因子表达资料及组间比较

Tab.5 Expression data of three cytokines and comparison between groups

GroupANGⅡTGF⁃β1VEGFNG6100±019100±025100±022HG6222±045196±039216±030HG+R16082±036082±037091±030HG+R26065±011071±010067±019HolisticanalysisF，P32377，000021298，000040471，0000HGvsNGLSD⁃t，P6887，00005489，00007879，0000HG+R1vsNGLSD⁃t，P1017，03211027，03170572，0574HG+R2vsNGLSD⁃t，P7903，00006515，00008451，0000HG+R1vsHGLSD⁃t，P1974，00621655，01142197，0040HG+R2vsHGLSD⁃t，P8861，00007143，000010076，0000HG+R2vsHC+R1LSD⁃t，P0958，03500628，05371625，0120

3 讨论

近三分之一的糖尿病病人患有糖尿病肾病，流行病学调查显示全球约有3.5亿人患有糖尿病，而其中约1亿患者患有糖尿病肾病，而30%的患者将会进展为肾衰竭[9]。糖尿病肾病主要特征为细胞外基质蛋白在肾小球细胞间隙累积，肾小球扩张，基底膜增厚，肾小管间质纤维化，是终末期肾衰竭的主要原因[10,11]。关于糖尿病肾病具体的发病机制尚不清楚，但是高血糖被认为是促进肾脏病变的动力因素。持续的高血糖能够促进很多与糖尿病肾病发病相关的细胞因子的表达如ANGⅡ，TGF-β1和VEGF等[12-14]，其中ANGⅡ能够诱导氧化应激反应，肾小球的高过滤，内皮细胞的损伤，血栓形成和炎症等过程；而高表达的TGF-β1可以促进细胞外基质成分的累积，凋亡和近端小管的上皮间质转化过程，并且研究发现低表达的TGF-β1可以改善糖尿病肾病，减少肾小球滤过率。细胞因子VEGF多次被报道参与内皮细胞的血管生成、迁移和增殖等过程，在糖尿病肾病的发病过程中，VEGF可以增加血管的渗透性[12,15]。此外，高表达的VEGF可以改变胞外的传导信号，促进细胞外基质的合成，刺激肾脏发生肥大。因此，目前迫切需要针对高糖因素在糖尿病肾病发生过程中的作用，寻找有效的治疗糖尿病肾病的方法。

雷帕霉素为mTOR的抑制剂，研究显示，PI3K/Akt可磷酸化mTOR具有负性调控作用的结节性硬化复合物1/2(Tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)，TSC1/2的磷酸化失活促使mTOR激活。活化的mTOR又可磷酸化激活核糖体蛋白激酶p70S6K，从而促进细胞的生长增殖。与此同时，p70S6K又可以促使HIF1-α与HIF1-β形成异源二聚体，进入细胞核，招募p300/CBP，启动VEGF的合成，促进VEGF生成增多[4,16]。因此雷帕霉素可抑制上述过程，抑制细胞的生长和细胞增殖，抑制VEGF的合成。

本研究中发现高糖培养条件能够明显促进大鼠肾系膜细胞的增殖和细胞周期的进展，抑制细胞的凋亡过程，与先前的文献报道一致，验证了高糖环境在糖尿病肾病发病过程中的作用。而雷帕霉素能明显抑制高糖对肾系膜细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响，说明雷帕霉素能够有效的抑制高糖刺激的肾小球系膜细胞的增生，甚至肥大的发生，该过程有助于预防或改善糖尿病肾病的进展[17]。此外，雷帕霉素还能够明显下调高糖刺激的ANGⅡ，TGF-β1和VEGF细胞因子的表达，如上文所述，这三个细胞因子在糖尿病肾病的发生与发展过程中的炎症反应、细胞的增殖和凋亡过程中发挥了极其重要的作用。而雷帕霉素很明显的下调了ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表达，这提示了雷帕霉素有可能是通过下调了高糖刺激的各种细胞因子的表达抑制肾系膜细胞的增殖，促进肾系膜细胞的凋亡过程，从而阻止高糖环境对肾小球系膜细胞的持续刺激。

本文总结，雷帕霉素可以明显逆转高糖对肾系膜细胞的影响，减缓高糖在糖尿病肾病发病过程中的作用，因此可以作为糖尿病肾病的一种治疗方法。

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[收稿2016-06-20 修回2016-07-15]

(编辑 许四平)

Effect of rapamycin on proliferation，apoptosis and cell cycles of high glucose-cultured rat glomerular mesangial cell

CHENJie,CHENXing-Qiang,FUWei-Wei.

DepartmentofNephrology,SanyaPeople′sHospital,Sanya572000，China

Objective:To evaluate the effects of rapamycin on the proliferation,apoptosis and cell cycle of glomerular mesangial cells induced by high glucose,and to explore its significance in the prevention and treatment of diabetic nephropathy.Methods: The rat GMC HBZY-1 was divided into four groups:control group,high glucose group,the first group of high glucose plus rapamycin,the second group of high glucose plus rapamycin.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of cells,flow cytometry was introduced to evaluate the apoptosis and cell cycle of HBZY-1,Real-time PCR was used to detect the mRNA of AngiotensinⅡ(ANGⅡ),transfor ming growth factor beta1(TGF-β1) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Results: The proliferation level of HBZY-1 induced by high glucose was significantly increased,and the level of apoptosis decreased,and the expression level of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF was increased.Rapamycin significantly inhibited,and there was a dose dependent,and down regulated the expression of ANGⅡ,TGF-β1,and VEGF.For the cell cycle,the S phase cells in the high glucose group were significantly higher than those in the normal group (P<0.05),and the S phase cell proportion was decreased after rapamycin intervention (P<0.05).Conclusion: Rapamycin can inhibit the proliferation of HBZY-1 in high glucose,promote its apoptosis and lead to G1/S arrest,and down regulate the expression of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF.

Rapamycin;High glucose;Glomerular mesangial cell;Proliferation;Apoptosis;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.009

陈 洁(1984年-)，男，主治医师，主要从事肾内科方面的研究，E-mail：ujmesz389@sina.com。

R587.2

A

1000-484X(2017)01-0047-05