AKT2在胶质瘤细胞中替莫唑胺化疗耐药的作用机制研究

崔勇，张风林，应奇，胡国汉，骆纯，卢亦成

·论著·

AKT2在胶质瘤细胞中替莫唑胺化疗耐药的作用机制研究

崔勇，张风林，应奇，胡国汉，骆纯，卢亦成

目的 研究AKT2基因在U251细胞株中对替莫唑胺化疗耐药中的作用机制。方法 体外将慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体转染胶质瘤U251细胞。应用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测RNA干扰AKT2后U251细胞对替莫唑胺敏感性的变化情况。流式细胞仪测定沉默AKT2基因表达后各组细胞凋亡的改变情况。AKT2-shRNA干扰胶质母细胞瘤细胞株U251的AKT2表达，进而采用Western blot实验方法，来进一步分析和评价AKT2与MDR-1、MRP-1、MGMT、bcl-2、caspase-3、P53等相关蛋白表达情况和相互调控关系。结果 CCK8法检测结果计算替莫唑胺对U251细胞的半数细胞抑制浓度(IC50)从U251空白对照组的(39.72±2.41)μg/ml、阴性对照组的(39.43±2.24)μg/ml降到(27.23±1.93)μg/ml，AKT2干扰组U251细胞对替莫唑胺药物的IC50值显著降低。流式细胞仪检测凋亡实验显示，与空白对照的U251细胞[调亡细胞(16.95±1.32)%]和转染阴性对照的U251胶质瘤细胞[调亡细胞(17.93±2.29)%]相比，转染AKT2 shRNA的U251细胞中早期、晚期调亡细胞明显增加，总调亡细胞达(38.16±4.83)%，干扰组凋亡水平有显著性增强(P<0.05)。AKT2-shRNA干扰U251后其凋亡明显增加，Real-time PCR和蛋白印迹实验结果提示bcl-2、survivin、MGMT明显下调，而caspase-3、PTEN、P53、beclin-1明显上调。结论 AKT2可能参与调控bcl-2、caspase-3、P53、survivin、beclin1等凋亡自噬相关蛋白及DNA损伤修复蛋白MGMT的表达，从而介导胶质母细胞瘤细胞株U251对替莫唑胺化疗抵抗。

脑胶质瘤；AKT2基因；替莫唑胺

替莫唑胺(TMZ)已成为临床上脑胶质瘤一线化疗药物。联用替莫唑胺与生物靶向药物以提高疗效和降低毒性反应是近年来最为活跃的研究领域之一。我们前期的实验研究表明替莫唑胺耐药细胞株中大量凋亡相关蛋白和DNA损伤修复蛋白发生了明显的变化，AKT2基因也在耐药株中明显上调[1]，进而推断AKT2在替莫唑胺胶质瘤化疗耐药中起着重要作用。本实验进一步研究AKT2-shRNA对U251替莫唑胺药物敏感性的作用调节机制。为今后研究人胶质瘤对替莫唑胺化疗耐药临床研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 慢病毒介导的AKT2-shRNA表达载体由中科院上海生命科学院协助构建。脑胶质瘤U251细胞(中科院上海生化与细胞所细胞库)，以含10%新生胎牛血清的细胞培养液中培养；shRNA试剂盒(Invitrogen公司)；兔抗人AKT2单克隆抗体(台湾Abnova公司)：Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(碧云天公司)。

1.2 人脑胶质瘤U251细胞的培养和转染 将处于对数生长期的U251细胞接种于6孔培养板，37℃，5%CO2培养箱培养。当细胞融合达70%，将AKT2-shRNA转染U251细胞。同时转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)特异性的shRNA(GFP-shRNA)作阴性对照。

1.3 CCK8法检测U251细胞对TMZ敏感性 细胞转染48 h后，分别收集转染和未转染的U251细胞。制成单细胞悬液后，分别接种于96孔培养板。直接在孔中加入培养基100 μl设置调零组，每组分别设5个重复。将上述配置好的工作液分别加入到各个孔中，并做好标识，于室温37℃,5% CO2条件下培养。培养至72 h后，倾去培养液，同时加入新鲜的培养基100 μl，每孔避光分别加入CCK8 10 μl，避光培养150 min后，酶标仪测定各组的光密度值。选择570 nm波长，酶标仪测定各孔的吸光度值(A)，记录结果。实验结果以细胞抑制率表示，细胞抑制率(%)=(1-实验组A值/空白对照组A值)×100%。进而根据公式计算半数抑制浓度(IC50)值。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测 收集各实验组对数生长期细胞，每组细胞3个复孔，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤细胞1次，每EP管中加入250 μl结合缓冲液悬浮细胞，转移到流式管中，每管中加入2.5 μl Annexin V-FITC混匀后，再加入2.5 μl PI,室温避光反应15 min,及时上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot检测U251细胞AKT2蛋白的表达 以未转染U251细胞为空白对照，转染48 h后，收集转染AKT2-shRNA和GFP-shRNA的U251细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次。加入5倍细胞悬液体积的组织蛋白裂解液，置冰上20 min，12 000 r/min离心30min。取上清10μl加入等体积的上样缓冲液混匀，煮沸10 min，离心取上清。将变性后的总蛋白100 μg经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V电泳至溴酚蓝达到凝胶底部。320 mA恒流2 h后将蛋白电转移到聚偏二氟乙烯膜。用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1 h。加入1∶1 000稀释的兔抗人AKT2单克隆抗体，4℃孵育过夜。1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG室温孵育1 h，化学发光剂于暗室中曝光和显影，检验AKT2蛋白条带，测定吸光度值(A)，以β-actin为内参照，表示AKT2蛋白的相对表达强度。

1.6 统计学方法 实验在相同条件下重复3次。两样本均数的比较采用t检验，多样本均数的比较采用ANOVA方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。统计分析采用SPSS 18.0统计软件包完成。

2 结 果

2.1 转染AKT2特异性shRNA后U251细胞对TMZ敏感性的变化 CCK8法检测U251细胞对替莫唑胺IC50实验结果显示，转染AKT2-shRNA的U251细胞对替莫唑胺的IC50值为(27.23±1.93)μg/ml，转染阴性对照组U251细胞对替莫唑胺的IC50值为(39.43±2.24)μg/ml，未转染的空白对照组U251细胞对替莫唑胺的IC50值为(39.72±2.41)μg/ml。这些结果表明，AKT2-shRNA U251细胞对化疗药物替莫唑胺的疗效和对照组相比明显增加(图1)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 AKT2-shRNA对U251细胞TMZ敏感性IC50的影响(*P<0.05)

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 采用FCM定量分析AKT2-shRNA组和对照组U251细胞调亡水平。实验结果显示，与空白对照的U251细胞[调亡细胞(16.95±1.32)%]和转染阴性对照的U251胶质瘤细胞[调亡细胞(17.93±2.29)%]相比，转染AKT2 shRNA的U251细胞中早期、晚期调亡细胞明显增加，总调亡细胞达(38.16±4.83)%，干扰组凋亡水平有显著性增强(P<0.05)。见图2。

2.3 Western blot检测结果 与阴性对照组相比，AKT2干扰组Bcl2、survivin蛋白表达下调；而caspa-se3、p53、PTEN、Beclin1表达上调。见图3、4。

图2 流式细胞仪定量分析U251细胞转染前后凋亡水平变化(* P<0.05)

图3 凋亡相关蛋白免疫印迹检测(*P<0.05) 图4 DNA损伤修复蛋白、转运蛋白免疫印迹检测(*P<0.05)

3 讨 论

人脑胶质瘤是中枢神经系统中最为多见的原发的恶性脑肿瘤，发病率在所有脑瘤中达到70%以上[2]。其治疗效果差，复发率高。化疗是胶质瘤综合治疗中的重要一环，但相当一部分患者治疗效果欠佳。新一代烷化剂替莫唑胺是目前对脑胶质瘤的标准化疗药物，在化疗治疗中发挥着重要作用[3-4]。并已被证明有着良好的临床治疗效果。由于化疗药物内在性和获得性耐药还有血-脑屏障的存在，影响了化疗效果[5]。

AKT2是近年来发现的一种原癌基因，该基因通过PI3K/AKT/mTOR等途径激活肿瘤增殖生长[6]。研究表明AKT2在肿瘤发生和进展中起着重要的作用，可能是肿瘤基因治疗理想的靶点和热点，并可能为增强化疗敏感性的关键基因之一[7]，许多传统的化疗药物都是通过引诱癌细胞的DNA损伤来发挥其细胞毒性作用的，因此一个细胞固有的DNA修复途径可以逆转细胞毒性药物的DNA损伤，从而介导化疗耐药。TMZ是目前神经外科对胶质瘤患者化疗的一线金标准口服烷化剂，虽然活性的DNA修复蛋白O6甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)已被描述为确定对胶质母细胞瘤(GBM)TMZ的敏感性影响的主要调剂蛋白，MGMT蛋白可以对胶质瘤细胞DNA烷化损伤采用甲基化特异性的修复，是一个化疗药物TMZ在胶质瘤肿瘤细胞中耐药的主要原因。尽管MGMT基因失活，GBM还是对TMZ化疗抵抗，这表明还有其他DNA修复机制也参与调节TMZ耐药，如碱基切除修复(BER)、错配修复(MMP)、核苷酸切除修复(NER)等[8-10]。即使在DNA造成的对肿瘤细胞的损伤未被很好的修复的情况下，肿瘤细胞还可以通过抑制凋亡信号途径使肿瘤细胞能够继续存活，从这些方面也不难看出癌症化疗耐药的分子机制异常复杂。

我们前期实验研究中以AKT2为中心构建的信号网络(singal-net)图显示AKT2基因对多个凋亡相关蛋白如caspase-3、bad、bcl-2、bax、survivin、TP53、caspase-9等起着重要的调控作用。研究显示，AKT2处于多个信号传导通路的交叉口，对肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭起着至关重要的作用。本实验流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，AKT2干扰组较对照组和空病毒阴性对照组相比凋亡明显上调，也再次验证了AKT2在肿瘤细胞中抑制凋亡的作用。蛋白印迹实验结果验证凋亡、自噬相关的蛋白bcl-2、caspase-3、P53、survivin、beclin-1、PTEN蛋白发生明显变化，而转运蛋白MDR1、MRP1没有明显变化，对DNA损伤修复相关蛋白ERCC1、XRCC1表达的影响没有一致的趋势，这还需要今后更多实验进一步验证AKT2是否调控这些蛋白。

从本实验结果推断，AKT2主要通过Bcl-2、p53、caspase-3、Survivin为替莫唑胺化疗耐药机制，胶质母细胞瘤等凋亡相关蛋白和途径。AKT2对DNA损伤修复蛋白MGMT也可能存在调控作用。但对一些MDR等转运蛋白可能没有直接调控作用，对碱基切除修复蛋白XRCC1、核苷酸切除修复蛋白ERCC1作用目前还不能肯定，还需再进一步验证和发现。本实验只针对U251一个细胞株进行的系统研究，有研究报道胶质母细胞瘤中不同种如U251、U373、SNB19虽然种属相同但其对化疗药物的敏感性不尽相同[11]，所以下一步实验将在胶质母细胞瘤中的U87、U373、SNB19等多个细胞株中进行上述凋亡自噬、DNA损伤修复相关蛋白的全面检测，更加深入的探讨AKT2 在胶质母细胞瘤中改变对替莫唑胺化疗效果影响的分子作用机制。尽早的将基础研究工作能应用于临床神经外科对胶质母细胞瘤患者的药物化疗中去，最大限度地减轻TMZ的化疗耐药。

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(收稿2016-08-07 修回2016-10-21)

The role of AKT2 in resistance totemozolomide in glioma cell line U251

CUIYong,ZHANGFeng-lin,YINGQi,etal.

DepartmentofNeurosurgery,411HospitalofPLA,Shanghai200081，China

Correspondingauthor：LUYi-cheng

Objective To explore the effects of AKT2 expression in U251 glioma cells on the sensitivity towards to temozolomide(TMZ).Methods The lentivirus vector of AKT2 shRNA was constructed and transfected into U251 cells．The changes of TMZ sensitivity after shRNA were examined by the CCK8 assay.Apoptosis of cells of each group was detected by flow cytometry cell technology.further analysis and evaluation of the AKT2 and the MDR-1,MRP-1,MGMT,and apoptosis related protein expression regulatory interaction used by Real-time PCR and Western Blot.Results the IC50 of U251 cell decreased from the blank control group (39.72±2.41)μg/ml,negative control group (39.43±2.24)μg/ml to (27.23±1.93) μg/ml,sensitivity of U251 cell to TMZ decreased significantly．Western blot results showed Bcl-2,survivin,MGMT was down regulated,and Caspase-3,PTEN,P53,beclin-1 increased.Conclusion AKT2 may be involved in the regulation of expression of apoptosis and autophagy related protein Bcl-2,Caspase-3,P53,survivin,Beclin1,and DNA damage repair protein MGMT,which mediates U251 chemotherapy resistance to TMZ.

glioma； AKT2； temozolomide

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.01.007

国家自然科学基金(30930094)

200081 上海，解放军第411医院神经外科(崔勇，张风林，应奇)；第二军医大学附属长征医院神经外科(胡国汉，骆纯，卢亦成)

卢亦成

R739.41

A

1672-7770(2017)01-0026-04