玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径的相关基因鉴定与结构特征分析

赵丰舟，刘震，侯巨梅，崔佳，左豫虎，刘铜

（黑龙江八一农垦大学农学院植物病理与应用微生物研究所，黑龙江大庆163319）

玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径的相关基因鉴定与结构特征分析

赵丰舟，刘震，侯巨梅，崔佳，左豫虎，刘铜

（黑龙江八一农垦大学农学院植物病理与应用微生物研究所，黑龙江大庆163319）

植物病原真菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径在调控病原菌附着胞形成和致病性等方面起重要作用。为了明确Fus3/Kss1-MAPK级联途径在玉米弯孢叶斑病菌中的调控作用，笔者采用生物信息学方法，对玉米弯孢叶斑病菌全基因组中的Fus3/Kss1-MAPK级联途径的相关基因进行鉴定并对其分子结构特征分析。结果表明：从玉米弯孢叶斑病菌中鉴定出Fus3/Kss1-MAPK级联途径中3个蛋白激酶基因Clf、Map2k、Clk1和一个锚定蛋白基因ClSte50。蛋白序列分析以及进化树构建等表明它们分别与来源其他植物病原真菌的Fus3/Kss1-MAPK途径中的激酶蛋白和锚定蛋白具有相似的结构特征和保守结构域，有较高同源性和较近的亲缘进化关系。玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白激酶Clk1、Map2k、Clf和锚定蛋白Clste50与其他真菌Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白结构相似，推断有相似的功能。

弯孢叶斑病菌；Fus3/Kss1-MAPK；级联途径；结构特征

0 引言

由新月弯孢[Curvularia lunata(Wakker)Boed]引起的玉米弯孢叶斑病已成为一种重要的叶部病害，对中国玉米生产造成了严重的损失[1-3]。由于目前药剂防治效果较差，在防治该病主要推广抗病品种为主。然而，研究发现‘玉米弯孢叶斑病菌’存在明显的生理分化和致病性变异[4-5]，一旦抗病品种丧失抗性，将直接威胁玉米生产安全。因此深入开展该菌致病性调控机理，可为设计新药剂提供新的靶位点，为持久，有效的防治该病奠定基础。随着对该病原菌致病机理的深入研究，发现环化腺普酸(cAMP)信号途径[6]、丝分裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导途径[5]和Ca2+信号途径[6]在致病性中起重要的调控作用。其中MAPK级联途径由三级酶联反应系统MAPKKK(mitogen activated protein kinase kinase kinase)-MAPKK(mitogen activated protein kinase kinase)-MAPK(mitogen activated protein kinase)所构成，最终通过激活MAPK激酶调控下游一系列基因表达来感应外境的信号，成为信号通路中研究最热点的问题。在植物病原真菌至少存在Slt2-MAPK途径、Hog1-MAPK和Fus3/Kss1-MAPK三条级联途径，其中Fus3/Kss1-MAPK途径在对病菌附着孢形成、分生孢子产生和致病性等方面有重要的调控作用[7]。例如在‘黄瓜炭疽病菌’(Colletotrichum orbiculare)中，Fus3/ Kss1-MAPK途径中的comekk1和cmk1基因敲除时其突变体增加了对高渗透压的敏感性[9]。在玉米小斑病菌中(Bipolaria maydis)，Fus3/Kss1-MAPK途径中ChSte11和Chk1基因可以调控分生孢子产生[10-11]。在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)中，发现了与Ste11-Ste7-Fus3/Kss1同源途径Mst11-Mst7-PMK1，对该途径中各个基因敲除时发现病菌不能产生附着孢和丧失致病性[7]。值得注意的是在‘酿酒酵母’(S.cerevisiae)中发现Fus1-MAPK和Slt2-MAPK级联途径可以与一些锚定蛋白互作，共同调控其生理功能。例如Fus1-MAPK级联途径发现一个锚定蛋白Ste5，它可以与Ste11、Ste7和Fus3互作调控交配与外激素反应途径[10]。2006年Park等[12]在‘稻瘟病菌’Mst11-Mst7-Pmk1途径中发现一个锚定蛋白Mst50，它可直接与Mst11和Mst7互作激活Pmk1基因调控附着孢形成和致病性，结果表明在Fus3/Kss-MAPK级联途径中可能存在一个与其互作的锚定蛋白，与级联途径共同来调控一些重要的生物学功能。生物信息学采用计算机方法实现分子数据的挖掘以及新的数据库的建立和发展，可以合理预测基因和蛋白质的序列信息，为分子数据分析提供了便利并得到广泛的应用。玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径与稻瘟病菌和玉米小斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径有不同的调控功能，可能与该病菌的无性产孢和致病性有关。目前Fus3/Kss1-MAPK级联途径在玉米致病菌新月弯孢侵染中的作用还未见报道。因此采用生物信息学的方法获得Fus3/Kss1-MAPK级联途径中蛋白激酶基因和锚定蛋白基因，对其分子结构特征进行分析，为下一步开展玉米弯孢叶斑菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径的调控功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 Fus3/Kss1-MAPK途径相关蛋白鉴定和序列分析

从NCBI数据库下载玉米致病菌新月弯孢(C. lunata)基因组(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ JFHG00000000)，利用BioEdit构建当地核苷酸和预测的蛋白质数据库。查询NCBI数据库和相关文献，获得酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中Fus3/Kss1-MAPK途径中各蛋白质的氨基酸序列。以酿酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌(M.oryzae)中Fus3/Kss1-MAPK途径中各蛋白的氨基酸序列为查询序列，设其E＜10-100，将从玉米弯孢叶斑病菌的蛋白质数据库中获取各自相应的蛋白质序列为侯选蛋白质序列。将这些侯选蛋白质序列提交到NCBI的在线工具CDD Search和SMART进行保守区域分析。

1.2 蛋白序列分析和进化树构建

从NCBI数据库中下载来源其他真菌的Fus3/ Kss1-MAPK途径中一些相应蛋白序列，分别与相应的侯选蛋白序列构成比对文件。采用Clustal W2程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)对这些比对文件进行分析，并输出到GENEDOC软件，分析其保守结构位点。采用MEGA5(http://megasoftware.net）软件进行系统发育进化树的构建，所用方法为邻近比较法。

2 结果与分析

2.1 Fus3/Kss1-MAPK途径相关蛋白鉴定

以酿酒酵母(S.cerevisiae)Fus3/Kss1-MAPK途径中Kss1(P14681.1)和Fus3(P16892.2)蛋白和稻瘟病菌PMK1(AAC49521.2)序列查询玉米弯孢叶斑病菌蛋白质数据库，获得E值最高的蛋白质序列CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_10006419，它分别与Kss1、Fus3和PMK1 E值为e-122、e-125和0，并且通过数据库查询，与以前发表的Clk1蛋白序列一致。表明该蛋白质可能为Fus3/Kss1-MAPK途径中MAPK激酶。同样以酿酒酵母(S.cerevisiae)和稻瘟病菌Fus3/ Kss1-MAPK途径中Ste7、Ste11、Ste50蛋白查询玉米弯孢叶斑病菌(C.lunata)蛋白数据库，分别获得相应的高度同源的蛋白质序列CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10010900、CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10009411和CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10006042。其中CURfmnDABDK AAPEI_GLEAN_ 10010900和CURfmnDABDKAAPEI_GLEAN_ 10009411氨基酸序列与数据库中已经命名为Map2K和Clf氨基酸序列相同，另CURfmnDABD KAAPEI_GLEAN_10006042被命名为ClSte50。将这4个氨基酸序列提交到NCBI的在线工具CDD Search和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析，发现Clk1和MAP2K含有激酶激活区，Clf与Ste11一样具有蛋白与蛋白相作区SAM、Ras结合区和激酶激活区，ClSte50与来源其他真菌的Ste50一样含有蛋白与蛋白相作区SAM和Ras结合区。4个相关蛋白其相关信息显示如表2和图1。

为进一步了解Fus3/Kss1-MAPK途径中蛋白的序列特征，采用Clustal X软件对3个激酶蛋白进行序列多重比对，结果表明，Clk1基因与所有MAPK家族一样含有“TEY”磷酸化唇保守结构域，以及蛋白激酶活性位点“D[L/I/V]K”（图2-A）。Map2k基因与其他真菌的Ste7一样，除含蛋白激酶活性位点“D[L/I/V]K”外，还具有SDIWS特征序列（图2-B）。Clf基因与其他来源真菌的Ste11一样含有“GSVFWMAPE”特征结构序列（图2-C）。

表1 来自玉米弯孢叶斑病菌(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途径相关基因信息

图1 玉米弯孢叶斑病菌(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途径相关基因保守结构域

为了进一步了解4个蛋白的进化来源和亲缘关系分析，分别下载了来源其他真菌的Fus3/Kss1-MAPK途径相关的蛋白进行遗传进化关系分析，结果显示表明Clk1与‘稻瘟病菌’的PMK1处于一个大的分支上，与‘链格孢’(Alternaria alternate)Fus3和‘玉米小斑病菌’(Bipolaria maydis)Pmk1亲缘关系最近（图3-A）。Map2k与‘稻瘟病菌’的Ste7处于一个大的分支上，与‘小新壳梭孢’(Neofusicoccum parvum)Ste7亲缘关系最近（图3-B）。Clf与‘玉米小斑病菌’和‘稻瘟病菌’Ste11处于同一个分支，具有一定的亲缘关系（图3-C）。ClSte50与‘玉米大斑病菌’的一个假定蛋白处于同一个小分支上，与‘稻瘟病菌’Ste50亲缘关系较近（图3-D）。由于相似的结构具有一定相似功能，同源蛋白具有相同的生物学功能，根据以上所有结果分析，明确玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径3个蛋白激酶基因分别为Clf、Map2k、Clk1和一个相关锚定蛋白为ClSte50。

图2 ‘玉米弯孢叶斑病菌’(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途径激酶保守结构域氨基酸序列比对

3 结论

笔者采用生物信息学方法首次对玉米弯孢叶斑病菌基因组的Fus3/Kss1-MAPK途径相关蛋白进行了分析与鉴定。Clk1基因拥有MAPK家族一样的“TEY”磷酸化唇保守结构域，与玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)Pmk1亲缘关系最近；Map2k基因与其他真菌的Ste7一样，具有SDIWS特征序列，与小新壳梭孢(Neofusicoccum parvum)Ste7亲缘关系最近；Clf基因含有Ste11基因的特征结构序列“GSVFWMAPE”，与玉米小斑病菌和稻瘟病菌Ste11处于同一个分支，具有一定的亲缘关系；ClSte50与稻瘟病菌Ste50亲缘关系较近。由于Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白激酶Clk1、Map2k、Clf和锚定蛋白Clste50分别与其他真菌的Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白结构相似，因此推断其功能相似。

4 讨论

植物病原真菌中至少存在3条MAPK途径，分别与‘酿酒酵母’(S.cerevisiae)的Fus3/Kss1-MAPK、Slt2-MAPK和Hog-MAPK途径有较高的同源性，各种途径在功能上相互独立，又具有一定重叠和协同作用，并且每种途径的功能在不同的植物病原真菌中存在较大的差异[13]。例如在稻瘟病菌中Osm1基因（与酵母Hog1同源）负责调控渗透压[14]，Mps1（与酵母Slt2同源）基因调控侵染钉与分生孢子的形成和细胞壁的完整性[15]；而在玉米小斑病菌中Mps1则可以调控病菌黑色素、毒性和分生孢子产生和病菌自溶，Hog1基因主要调节渗透压和氧压、附着孢形态和致病性[16]。稻瘟病菌中Pmk1（与酵母Fus3/Kss1基因同源）调控附着胞的形成、侵入丝的生长和致病性[17]；在玉米小斑病菌的Pmk1可调控疏水蛋白、黑色素、次生代谢产物的形成[18]；然而研究报道玉米弯孢叶斑病菌中Clk1基因缺失可以影响病菌分生孢子产生和致病性[19]，Clf基因敲除病菌不能正常产孢（未发表），这些结果表明玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径与稻瘟病菌和玉米小斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径有不同的调控功能，可能与该病菌的无性产孢和致病性有关。因此开展玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径研究，将有助于探索MAPK途径对玉米弯孢叶斑病菌产孢和致病性调控机理，将为研制新型杀菌剂提供新的更多的靶位点。

图3 ‘玉米弯孢叶斑病菌’(C.lunata)Fus3/Kss1-MAPK途径相关蛋白系统进化树

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Identification and Structure Characteristics of Related Genes of Fus3/Kss1-MAPK Pathway from Curvularia lunata

Zhao Fengzhou,Liu Zhen,Hou Jumei,Cui Jia,Zuo Yuhu,Liu Tong

(Institute of Plant Pathology and Applied Microbiology,College of Agronomy,Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319,Heilongjiang,China)

The cascade pathway of Fus3/Kss1-MAPK in plant pathogenic fungi plays an important role in regulating appressorium development and pathogenicity.In order to investigate the role of Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway in‘Curvularia lunata’,we used bioinformatics methods to identify the related gene of the Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway from‘Curvularia lunata’in genome-wide and analyzed the molecular structure characteristics of Fus3/Kss1-MAPK related gene.The result showed that three protein kinases genes of Clf,Map2K,Clk1 and an ankyrin gene Clste50 were identified based on genome of‘Curvularia lunata’.The protein sequence analysis and phylogenetic tree construction showed that Clf,Map2k,Clk1 and Clste50 in‘Curvularia lunata’all contained similar structural features and conservative domains with those of other plant pathogenic fungi,and had high homology and close phylogenetic relationships.The related protein kinases genes Clf,Map2K,Clk1 and an ankyrin gene Clste50 of the Fus3/Kss1-MAPK cascade pathway from‘Curvularia lunata’were similar to the protein structures with other fungi.Those results may indicate that they have similar function in appressorium development and pathogenicity.

Curvularia lunata;Fus3/Kss1-MAPK;Cascade Pathway;Structure Characteristics

S435.131

A论文编号：cjas16030014

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目“玉米弯孢叶斑病菌多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因鉴定及其在致病性中的作用研究”(YJSCX2015-Y06)；国家自然科学基金资助项目“基于microRNA的抗玉米弯孢叶斑病分子调控机理研究”(31272026)。

赵丰舟，女，1987年出生，黑龙江绥化人，研究生，研究方向为分子植物病理学。通信地址：163319黑龙江八一农垦大学农学院植物病理与应用微生物研究所，Tel：0459-6819133，E-mail：521zhaofengzhou@163.com。

左豫虎，男，1965年出生，河南新郑人，教授，博士，主要从事植物病理学研究。通信地址：163319黑龙江八一农垦大学农学院，Tel：0459-6819133，E-mail：zuoyhu@163.com；刘铜，男，1978年出生，江西萍乡人，副教授，博士，主要从事玉米病害研究。通信地址：163319黑龙江八一农垦大学农学院，E-mail：liutongamy@sina.com。

2016-03-16，

2016-06-21。