EGFR抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及侧群细胞作用的研究

2017-02-14巩超捷唐燕夏璐

浙江医学 2017年1期

巩超捷唐燕夏璐

巩超捷唐燕夏璐

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及侧群（SP）细胞的作用机制。方法应用Hoechst33342染色、流式细胞仪检测HT29中CD44+细胞以及SP细胞比例和成瘤性，并对不同浓度EGFR抑制剂吉非替尼作用后球囊形成及SP细胞比例、不同化疗药物处理后CD44+细胞比例进行分析与比较。结果空白对照组HT29中SP细胞比例为（3．82±0．08）%，经维拉帕米阻断后降为（0．34±0．03）%，吉非替尼10、15μmol/L作用48h后HT29中SP细胞比例明显降低（均P＜0．01），5-氟尿嘧啶（5-FU）作用48h后SP细胞比例变化不大（P＞0．05）。与空白对照组比较，吉非替尼7．5、10、15μmol/L作用24、48h后CD44+细胞比例均明显降低（均P＜0．05）；且随着吉非替尼的浓度增大，CD44+细胞比例逐渐降低（P＜0．05）。与空白对照组比较，多烯紫杉醇、顺铂作用24、48h后CD44+比例均明显增大（均P＜0．05）。随着时间延长，加入不同浓度的吉非替尼对球囊形成均具有抑制作用。结论EGFR抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及SP细胞具有生长抑制作用，且可抑制球囊形成。

CD44+侧群细胞吉非替尼结肠癌

结肠癌是第三大常见恶性肿瘤，尽管诊疗水平不断提高，但由于术后肿瘤复发等问题，5年生存率依然较低[1]。相关研究发现，来源于结肠隐窝细胞的结肠肿瘤干细胞对肿瘤的复发和转移具有重要影响[2]，其增殖分化可能受到生长因子[表皮生长因子（EGF）、血管源性生长因子（VEGF）和纤维母细胞生长因子（FGF）]的调控与影响。其中EGF对CD133+标记的肿瘤干细胞增殖具有明显促进作用[3]，可提高UMSCC10B和HN12这两种人头颈部鳞癌细胞系中侧群（SP）细胞比例[4]，而EGF受体（EGFR）抑制剂——吉非替尼可以降低SP细胞比例[5]。以上研究结果表明EGFR抑制剂或许能有效抑制结肠癌肿瘤干细胞增殖分化，在结肠癌靶向治疗方面具有潜在的临床意义。目前，关于EGFR抑制剂对结肠癌干细胞作用的研究较少，且具体机制尚未清楚。本研究以人结肠癌细胞株HT29为对象，观察吉非替尼对细胞中CD44+细胞以及SP细胞比例的影响，并探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及主要试剂人结肠癌细胞株HT29购自上海信裕生物科技有限公司，由上海交通大学附属瑞金医院内科实验室保存。主要试剂：烟酸己可碱（德国Hoechst公司），鼠抗人FITC-CD44单克隆抗体（美国Becton Dickinson公司），Hoechst33342、胰岛素、B27因子、胎牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、AnnexinV/碘化丙啶（PI）、噻唑蓝染色液均购自美国Sigma公司，0.5%及0.05%Trypsin-EDTA、RPMI1640细胞培养液、DMEM/ F12细胞培养液、牛血清白蛋白BSA均购自美国Gibco公司，重组表皮生长因子EGF、碱性成纤维生长因子bFGF均购自美国PeproTech公司，维拉帕米（英国Tocris公司）。吉非替尼（商品名：易瑞莎，阿斯利康公司）溶于DMSO中，储存浓度为20μmol/L，-20℃保存，每次实验前用新鲜培养基稀释至所需浓度，其中DMSO浓度不超过1‰；5-氟尿嘧啶（5-FU）购自上海旭东海普药业有限公司；顺铂、多烯紫杉醇均购自浙江恒瑞药业公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养（1）HT29培养：HT29接种于含10%胎牛血清的培养基（SSM）中，传代培养，待细胞处于对数生长期，用PBS清洗，0.5%Trypsin-EDTA消化。（2）球囊形成及传代培养：HT29消化、清洗，台盼蓝染色计数活细胞后，以5×105/ml浓度重悬于无血清培养基（SFM）中形成球囊，球囊传代用0.05%Trypsin-EDTA消化。

1.2.2 细胞噻唑蓝染色（MTT）A组单用吉非替尼，终浓度分别5、7.5、10、12.5、15μmol/L；B组只加入等量DMSO，作为空白对照。将细胞浓度为5×103/L的HT29接种于96孔板，每孔200μl，24h后换液，按上述分组情况处理细胞，设置3个复孔，置于恒温孵育箱内继续培养。培养24、48h后，应用MTT法于570 nm波长处测得吸光值（A），计算药物的细胞增殖抑制率=（1-A实验组/A对照组）×100.00%，并作出量效曲线，求出药物的50%生长抑制剂量（IC50，细胞对药物敏感性指标）。每次实验重复3次。

1.2.3 Hoechst33342染色检测不同药物作用后SP细胞比例选择对数生长期的细胞，消化、漂洗、离心，将细胞以5×105/L接种于6孔板，每孔3ml，24h后换液，A组单用吉非替尼，终浓度分别为5、10、15μmol/L；B组加入用表示，不同浓度药物组与空白对照组比较采用两独立样本t检验；不同浓度吉非替尼作用24、48h后CD44+细胞比例比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果

2.1 吉非替尼对细胞增殖的抑制率吉非替尼对HT29的作用较为敏感，IC50=（10.27±0.77）μmol/L；随着浓度增大，细胞增殖抑制率逐渐增高。

2.2 吉非替尼对SP细胞的作用空白对照组HT29中SP细胞比例为（3.82±0.08）%，见图1a；经维拉帕米阻断后降为（0.34±0.03）%，其流式细胞图见图1b。吉非替尼10、15μmol/L作用48h后HT29中SP细胞比例分别为（0.01±0.01）%和0%，明显低于空白对照组（均P＜0.01），其流式细胞图见图1c-d；5-FU作用48h后SP细 5-FU，终浓度分别为10、15、20μmol/L；C组加入维拉帕米，终浓度为维拉帕米50μg/ml；D组为空白对照。48h后收集细胞并重悬于含3%胎牛血清的2ml RPMI1640培养液中，密度1×106/ml，加入Hoechst33342至终浓度为5μg/ml。将细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育90min，每隔15min轻轻晃动离心管（15ml）1次，使染料分布均匀；将细胞置于4℃低温离心，去尽培养液，用冰冷的PBS冲洗2次，加入冰冷的3%胎牛血清的RPMI1640培养液2ml及PI至终浓度为2μg/ml，上机分选。使用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）去除PI染色阳性死细胞，收集SP细胞和非侧群（non-SP）细胞[7]。

1.2.4 吉非替尼对球囊形成的影响观察收集球囊细胞，经0.05%Trypsin-EDTA消化，处理后接种于非黏附6孔板（德国Greiner公司）中，24h后加入不同浓度的吉非替尼，作用第5、8天在倒置显微镜下观察球囊形成，并观察与对照组的差异。

1.2.5 不同化疗药物处理后HT29中CD44+细胞比例的检测收集HT29，0.5%Trypsin-EDTA消化、PBS漂洗、离心，将细胞以5×105/L接种于6孔板，每孔3ml，24h后换液，A组单用吉非替尼，终浓度分别为5、10、15μmol/L；B组加入多烯紫杉醇，终浓度分别为6、8、10nmol/L；C组单用顺铂，终浓度分别为8、12、16μmol/L；D组为空白对照。设置2个复孔。药物作用24、48h后分别收集细胞，重悬于PBS中，细胞计数约1×106/ml，用鼠抗人FITC-CD44单克隆抗体标记，置于4℃孵育20 min；PBS洗2次，使用流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）检测和分选，重复检测3次。

1.3 统计学处理应用SPSS 20.0统计软件。计量资料胞比例为（3.10±0.07）%，与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其流式细胞图见图1e。

2.3 吉非替尼对球囊形成的影响随着时间延长，加入不同浓度的吉非替尼均对球囊形成具有抑制作用，球囊细胞大部分调亡，见图2-3。

2.4 不同化疗药物对HT29中CD44+细胞比例的作用与空白对照组比较，吉非替尼7.5、10、15μmol/L作用24、48h后CD44+细胞比例均明显降低（均P＜0.05）；随着吉非替尼的浓度增大，CD44+细胞比例均逐渐降低（均P＜0.05）。与空白对照组比较，多烯紫杉醇、顺铂作用24、48h后CD44+比例均明显增大（均P＜0.05），见表1。不同化疗药物作用48h后HT29中CD44+细胞比例的流式细胞图，见图4。

图1 吉非替尼与5-FU对HT29中SP细胞作用后的流式细胞图[a：Hoechst33342（空白对照）；b：Hoechst33342+维拉帕米；c：吉非替尼10μmol/L；d：吉非替尼15μmol/L；e：5-Fu 20μmol/L]

图2 不同浓度吉非替尼作用5d后球囊形成情况（a：空白对照；b：10μmol/L；c：15μmol/L；×100）

图3 不同浓度吉非替尼作用8d后球囊形成情况（a：空白对照；b：10μmol/L；c：15μmol/L；d：20μmol/L；×200）

3 讨论

表1 不同化疗药物作用24、48h后HT29中CD44+细胞比例（%）

EGFR是细胞表面erbB受体家族中的一员，主要与细胞增殖、生长、迁移、浸润与存活等有关，在结肠癌形成与转移中发挥着重要作用[6]。多种药物与物质可通过EGFR信号途径发挥抑制结肠癌干细胞增殖的作用[7-8]。本研究选用临床治疗转移性结肠癌患者的小分子靶向药吉非替尼（EGFR酪氨酸激酶抑制剂）作为EGFR抑制剂，来研究EGFR在肿瘤球囊细胞增殖和CD44+细胞中的作用。吉非替尼是一种选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，对结肠癌细胞系HT29和LoVo增殖具有明显的抑制作用[9]。动物试验或体外研究已证实吉非替尼可提高化疗、放疗及激素治疗的抗肿瘤活性[10]。结肠癌干细胞在结肠癌的复发和转移中发挥着重要作用，会使癌细胞对化疗产生耐受[11]，直接导致结肠癌复发和转移[12]。本研究发现，吉非替尼能够减少HT29细胞中SP细胞比例，提示吉非替尼能抑制肿瘤样干细胞增殖。Mimeault等[13]研究发现吉非替尼能够抑制前列腺癌细胞中SP细胞比例，与多烯紫杉醇、环巴胺存在协同效应。Ma等[5]研究发现吉非替尼能通过EGFR/AKT/βcatenin途径抑制鼻咽癌SP细胞比例。以上研究结果均表明吉非替尼可能通过抑制肿瘤干细胞比例而发挥抗癌作用。

本研究发现吉非替尼可抑制人结肠癌干细胞中EGF与EGFR结合，对HT29具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用，从而抑制HT29球囊形成。与常用化疗药物相比，吉非替尼对HT29中的结肠癌肿瘤干细胞（包括SP细胞和CD44+细胞）更为敏感，其抑制作用呈剂量-反应关系。这表明吉非替尼对结肠癌干细胞具有特异性的作用。Nautiyal等[14]研究发现EGFR抑制剂能降低结肠癌细胞上干细胞样标志物（CD166和乙醛脱氢酶-1）和miRNA-21的表达，提示吉非替尼可通过特定的机制发挥作用。

综上所述，EGFR抑制剂对人结肠癌细胞株HT29中CD44+细胞及SP细胞具有生长抑制作用，且可抑制球囊形成。

图4 不同化疗药物作用48h后HT29中CD44+细胞的流式细胞图（a：空白对照；b：吉非替尼7.5μmol/L；c：吉非替尼10μmol/L；d：多烯紫杉醇6nmol/L；e：多烯紫杉醇8nmol/L；f：顺铂12μmol/L）

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Effect of epidermal growth factor receptor inhibitor on CD44+cells and side population cells of human colon cancer cell lineHT29

ObjectiveTo explore the effect of epidermal growth factor receptor(EGFR)inhibitor on CD44+and side population(SP)cells in colon cancer HT-29 cells．MethodsThe proportion and tumorigenicity of CD44+cells and SP cells was detected by Hoechst33342 staining and flow cytometry．The effects of EGFR inhibitor gefitinib at different concentrations on the sphere formation and the proportion of CD44+cells and SP cells were analyzed．ResultsEGFR inhibitor significantly inhibited the growth of CD44+cells and SP cells．The proportion of CD44+cells in HT29 cells was decreased after treatment with gefitinib for 24h and 48h．The proportion of SP cells in HT29 cells was decreased from(3．82±0．08)%to(0．34±0．03)%after verapamil treatment．It was also decreased significantly after gefitinib treatment．Gefitinib had an inhibitory effect on the sphere formation in HT29 cells．ConclusionThere are CD44+and SP cells subpopulation in colon cancer cells．EGFR inhibitor can inhibit the growth of CD44+and SP cells in colon cancer HT-29 cells,which may provide information for targeting therapy of colon cancer．

CD44+Side-population cellsGefitinibColon cancer