稻曲病菌薄壁分生孢子制备的影响因素分析

时婷婷, 王忠文, 蔡 超, 杨 平, 覃 茜, 张君成

(广西大学农学院, 南宁 530004)

稻曲病菌薄壁分生孢子制备的影响因素分析

时婷婷, 王忠文, 蔡 超, 杨 平, 覃 茜, 张君成*

(广西大学农学院, 南宁 530004)

本文研究了培养基、温度、振荡速度等因素对稻曲病菌Ustilaginoideavirens薄壁分生孢子产孢量的影响。结果表明,稻曲病菌薄壁分生孢子在培养第7天基本达到最大孢子量;该菌最适宜产孢的培养基为马铃薯煮汁,在煮汁中添加蔗糖可大幅提高产孢量;适宜的产孢温度为26～28℃;静止培养不利于产孢,振荡培养有利于产孢,并表现为转速越高产孢量越多;光照条件对产孢量没有影响。

稻曲病菌; 薄壁分生孢子; 产孢; 培养制备

由稻曲病菌Ustilaginoideavirens(Cooke) Takahashi侵染引起的稻曲病是水稻生产上的重要病害。对该病害的某些方面的研究已相当深入,如在病原菌分子生物学方面,已成功构建了首个BAC文库,并已获得了病菌全长基因组信息[1];Zhang等从该病菌中分离获得一些具病毒性质的dsRNA片段[2]。但该病害的一些基础研究仍然比较薄弱,如对该病菌的生存繁殖生物学的了解有限,人工诱发该病害的技术还不够成熟。这直接造成至今对该病害的侵染循环仍不十分清楚,也导致一些与防病控害有关的重大问题,如病菌的致病性与致病机理及寄主抗病性与抗病机理的研究进展缓慢。可见,加强相关基础研究十分必要,而病菌的繁殖体通常是基础研究的必需材料。

稻曲病菌繁殖体包括3种形态的孢子：子囊孢子、厚壁分生孢子和薄壁分生孢子[3-4]。目前,实验室获取子囊孢子的技术难度大,有关研究多采用无性孢子。而在实验室培养获取纯净的厚壁分生孢子也存在一些不易克服的技术障碍,虽然该菌的厚壁分生孢子可以很方便地从发病稻田中大量获取,但此来源的孢子受到生长季节的限制,也存在容易被污染的严重缺陷。因而许多基础研究使用的材料往往是薄壁分生孢子[5]。获取薄壁分生孢子,通常采取液体培养基振荡培养的方法[6]。本文对培养基、温度和光照等对孢子制备效果的影响进行了初步测定。

1 材料与方法

1.1 菌株

稻曲病菌菌株Uv-105、Uv-110、Uv-2、Uv-6、Uv-24、Uv-54由广西大学农学院植物病理学实验室提供。除不同菌株产孢量测定采用全部菌株外,其余测试项均以Uv-105、Uv-110为材料。

1.2 定量移植菌丝块的准备

用移液管吸取纯化的菌株孢子液100 μL 均匀地涂布在PSA(马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL)平板上,置于28 ℃温箱黑暗下培养4 d,至平板均匀长满菌丝,用0.5 cm的打孔器打孔,获得菌丝量一致的琼脂菌丝块,在如下各因素测定中定量移植1块菌丝块作为振荡培养初始菌量(另有指明的除外)。

1.3 产孢量与培养时间的关系

将菌丝块移入装液量为80 mL(下同)的PS培养液(马铃薯200 g、蔗糖20 g、水1 000 mL),置于摇床中在28 ℃、转速140 r/min下培养,每菌株设置3个重复,每重复培养1瓶。1 d后开始检测产孢量,以后每2 d取样用血球计数板检测产孢量,分析15 d内随培养时间延长产孢量的变化。

1.4 不同菌株的产孢量

将菌株Uv-2、Uv-6、Uv-24、Uv-54、Uv-105、Uv-110在PSA斜面上活化培养,再移植少许已活化的菌丝体到PSA平板中心培养6周,用0.5 cm打孔器在菌落周缘打孔,移植1菌丝块至PS培养液中,在28 ℃、140 r/min条件下振荡暗培养。每菌株设置3个重复,每重复培养1瓶,培养4 d 后用血球计数板测定产孢量。

1.5 培养基对产孢量的影响

用蒸馏水分别将马铃薯、甘薯、胡萝卜、花生芽、干燕麦粒、干大米粒煮汁制成培养基,鲜组织用量为200 g/L,干组织用量为30 g/L。同时设置每种煮汁中添加蔗糖20 g/L的培养基。其他培养基包括:牛肉膏蛋白胨(牛肉膏3g、蛋白胨5 g、水1 000 mL)、酵母膏(酵母膏5 g、水1 000 mL)、理查[硝酸钾10 g、磷酸二氢钾5 g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.5 g、氯化铁0.02 g、葡萄糖34 g、水1 000 mL]、查彼[硝酸钾2 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL]和高氏一号(可溶性淀粉20 g、硝酸钾1 g、磷酸二氢钾0.5 g、氯化钠0.05 g、硫酸铁0.01 g、水1 000 mL)。培养基中移入菌丝块后于28℃,140 r/min条件下振荡培养,每个培养基设置2个重复,每重复培养1瓶,培养5 d后用血球计数板测定产孢量。

1.6 温度、振荡速度和光照对产孢量的影响

培养温度对产孢量的影响:采用PS培养液,设摇床为黑暗状态,转速140 r/min,在20、24、25、26、27、28、32℃下振荡培养。每个培养温度设置3个重复,每重复培养1瓶,4 d后用血球计数板测定产孢量。

振荡速度对产孢量的影响:采用PS培养液,在 28℃,黑暗状态下,分别在0、70、140、175、210 r/min下进行振荡培养,每个振荡速度设置3个重复,每重复培养1瓶,4 d后用血球计数板测定产孢量。

光照条件对产孢量的影响:采用PS培养液,在28℃,转速140 r/min条件下振荡培养,设置3种光照条件:全黑暗、全光照、及L∥D=12 h∥12 h。每个光照条件设置3个重复,每重复培养1瓶,4 d后用血球计数板测定产孢量。

2 结果与分析

2.1 产孢量与培养时间的关系

稻曲病菌2个菌株Uv-105、Uv-110在初始菌丝量为1块的条件下,第1～5 天属于孢子数量快速增长期, 5 d后孢子数量增速下降,曲线逐步变平缓,7 d后产孢数量增幅不大,逐渐趋于饱和(图1)。依此结果,后续试验的培养时长选择为4～5 d。

图1 培养不同时长后2个菌株的产孢数量Fig.1 Spore yield of 2 strains cultured for different days

2.2 不同菌株的产孢量

菌株Uv-110培养4 d后,其产孢量达22.7×104个/ mL,而菌株Uv-2和Uv-6未检测到孢子(图2),表明不同菌株间的产孢能力差异悬殊。

图2 不同菌株的产孢量Fig.2 Spore yield of different strains

2.3 培养基对产孢量的影响

菌株Uv-105、Uv-110在不同的培养基上产孢量差异悬殊,在马铃薯煮汁培养基上的产孢量最多;在营养丰富的牛肉膏蛋白胨或酵母膏上的产孢量并不高,在寄主水稻的稻米煮汁培养基上的产孢量也不高;在合成培养基上菌株产孢很少或未检测到孢子产生(表1),表明该菌在产孢过程中对营养成分有较严格的要求,某些培养基含有促进产孢的营养成分,以马铃薯的营养成分最适宜稻曲病菌产生薄壁分生孢子。

值得注意的是,在6个含植物煮出汁液中添加蔗糖可大幅提高产孢量(表1),表明稻曲病菌在形成薄壁分生孢子的过程中,要求有充分的碳素营养。

表1 Uv-105和Uv-110在不同培养基上的产孢量1)

Table 1 Spore yield of strain Uv-105 and Uv-110 cultured on different media

培养基Medium产孢量/×104个·mL-1 SporeyieldUv-105不加蔗糖Withoutsucrose加蔗糖WithsucroseUv-110不加蔗糖Withoutsucrose加蔗糖Withsucrose马铃薯Potato(164.67±13.33)b(238.83±23.17)a(176.33±9.00)b (343.67±42.33)a花生芽Peanutsprout(51.00±3.67)def(137.00±5.67)c(76.33±3.00)cd(157.67±6.33)b胡萝卜Carrot(41.00±4.33)ef(118.00±3.33)c(73.07±35.33)cde(90.67±4.67)c红薯Sweetpotato(34.67±1.33)fgh(72.67±0.00)d(37.00±3.00)def(91.33±1.33)c大米Rice(16.23±0.97)ghij(58.67±0.67)de(17.20±3.13)f(50.63±11.37)ef燕麦Oat(6.23±1.10)ij(14.07±2.40)hij(9.53±3.67)f(22.73±6.67)ef牛肉膏蛋白胨Beefextractpeptone(37.67±8.33)efg-(48.97±28.97)cdef-酵母膏Yeastextract(28.00±1.27)fg-(20.43±9.17)ef -查彼Czapek(4.80±2.33)ij-(4.26±0.07)f -高氏一号Gauze’smediumno.1(0.00±0.00)j-(0.00±0.00)f -理查Richards’medium(0.00±0.00)j-(0.00±0.00)f -

1) 表中数据为平均值±SE,相同菌株数据后标有相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验差异不显著(P>0.05)。下同。 Data in the table are presented as mean ± SE.Data in the same strain followed by same small letters indicates no significant difference by Duncan’s new multiple range test at 0.05 level.The same below.

2.4 培养温度对产孢量的影响

低温和高温条件下产孢量少,26～28℃属于较适宜的产孢温度,27℃下产孢量最多(Uv-105为30×104个/ mL, Uv-110为28.80×104个/ mL)(图3),显然培养温度对产孢量有较大的影响。

2.5 振荡速度对产孢量的影响

静置(转速为零)培养的培养基中未检测到孢子;振荡培养时,转速在210 r/min内,产孢量随转速的增加而增加,但转速大于140 r/min时,产孢量的增加幅度不大(表2)。表明静止培养不利于产孢,振荡培养有利于产孢,产孢量与振荡速度有关。

2.6 光照条件对产孢量的影响

3种光照条件下两个菌株产孢量均无明显差异(表3),表明光照条件对稻曲病菌薄壁分生孢子的产孢量没有影响。

图3 不同培养温度下Uv-105和Uv-110菌株的产孢量Fig.3 Spore yield of Uv-105 and Uv-110 cultured at different temperatures

振荡转速/r·min-1Shakingspeed产孢量/×104个·mL-1 SporeyieldUv-105Uv-1100(0.00±0.00)e(0.00±0.00)d70(8.18±0.40)d(10.87±0.71)c140(26.53±0.66)c(25.22±3.04)b175(33.71±0.76)b(35.27±1.95)a210(38.24±0.91)a(32.82±0.96)a

表3 不同光照条件下Uv-105和Uv-110的产孢量

Table 3 Spore yield of Uv-105 and Uv-110 cultured at different light conditions

光照条件Lightcondition产孢量/×104个·mL-1 SporeyieldUv-105Uv-110全黑暗Fulldarkness(24.73±6.74)a(24.67±0.53)a全光照Fulllight(25.62±10.86)a(23.96±0.42)aL∥D=12h∥12h(26.38±5.76)a(26.29±0.79)a

3 讨论

本试验结果显示,培养时间长短是孢子数量增加积累的重要因素,但孢子数量的增加主要集中在培养的前7 d,考虑到长时间培养获得的薄壁分生孢子的萌发率下降[7],因而实际工作中,培养7 d已足够。

不同菌株的薄壁分生孢子产孢能力差异悬殊,与有关报道认为不同菌株的厚壁分生孢子产生情况有相似之处[8],但同一菌株产生这两种孢子是否有相关性还不清楚,不管如何,进行有关的研究,应先对菌株材料的产孢能力有所了解,需要应用大量孢子的,应先筛选产孢量大的菌株。

在不同培养基中稻曲病菌薄壁分生孢子产量差异悬殊,因此要制备大量孢子时,选择合适的培养基很关键。很巧合,实验室常备的含马铃薯汁的培养基为最适宜的产孢培养基。据报道,在大米培养基上稻曲病菌的另一种无性孢子(厚壁分生孢子)的产孢量比在PSA上的多[9-10],而薄壁分生孢子在含大米汁的培养基中产孢量反而比PS培养液中的少,可能是该病菌这两种无性孢子的形成所需要的关键营养成分不一样。

形成薄壁分生孢子的适宜温度为26～28℃,与该病菌另一形态无性孢子(厚壁分生孢子)形成适宜温度一样[11],表明该病菌两种形态无性孢子形成的感温生理有相似性。当温度升高至32℃时,薄壁分生孢子产生量急剧下降,显然高温对产孢极为不利,因此,夏天培养制备孢子最好应具备降温培养条件。

该病菌在振荡培养下可产生大量薄壁分生孢子,而同时静止培养的几乎未发现孢子产生。由于振荡培养具有向培养液充氧的作用,可能该孢子的形成需要充分的氧气供应。不过,在直接与空气接触的固体平板上的大菌落,该病菌却很少产生薄壁分生孢子,因而单从氧气条件难以解释稻曲病菌的产孢现象,可能液态水的存在是该孢子形成的另一必要条件。该病菌的液体培养产孢特性与镰孢菌类的特性一样[12],不过,镰孢菌类在固体平板培养基上能正常产生孢子[13],与稻曲病菌的产孢机理有差异。

虽然振荡速度越高产孢量越大,但高速振荡容易使液体漂溅瓶塞,导致污染,也容易出现培养瓶碰甩事故。由于140 r/min与210 r/min的产孢量差异并非太大,作者认为采用140～160 r/min较为有利和安全。

光照对稻曲病菌薄壁分生孢子形成没有影响,说明该孢子的形成对光不敏感,因而在制备孢子时无需增加光照条件。据报道,光照可诱导某些病原菌产生孢子[14],光照也能诱导稻曲病菌形成厚壁分生孢子[15],稻曲病菌两种无性孢子对光照反应的差异,也说明该病菌这两种无性孢子的产孢机理不一样。

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(责任编辑：杨明丽)

Study on factors influencing preparation of thin-walled conidia ofUstilaginoideavirens

Shi Tingting, Wang Zhongwen, Cai Chao, Yang Ping, Qin Qian, Zhang Juncheng

(CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning530004,China)

The effect of medium, temperature, and shaking speed, etc.on the yield of thin-walled conidia of fungusUstilaginoideavirenswas studied in this paper.The results showed that the maximum amount of conidia was got 7 days post start of growth.Potato broth was the best medium for sporulation of the fungus, and spore yield could be increased greatly when sucrose was added to the broths.Suitable temperature for sporulation was 26-28℃.Static culture was unfavorable way for sporulation.Shaking culture was favorable way for sporulation, and spore yield increased with increase of rotate speed.Different light conditions showed no effect on the spore yield.

Ustilaginoideavirens; thin-walled conidia; sporulation; preparation

2015-12-18

2016-01-28

广西自然科学基金(2011GXNSFA018068)

S 435.111

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.022

* 通信作者 E-mail:jczhang@gxu.edu.cn