miR-26b在卵巢癌组织中的表达与功能

陈 诚 游雪云 付子毅

(抚州市妇幼保健院，江西 抚州 344000)

miR-26b在卵巢癌组织中的表达与功能

陈 诚 游雪云1付子毅2

(抚州市妇幼保健院，江西 抚州 344000)

目的 探讨microRNA-26b(miR-26b)在卵巢癌组织中的表达情况，并探讨其对卵巢癌细胞株HO8910恶性行为的影响。方法 采用实时定量PCR(qPCR)检测72例卵巢癌患者经手术切除的上皮性卵巢癌组织标本(卵巢癌组)中的miR-26b水平，同时选取26例正常卵巢上皮组织(正常组)和45例良性卵巢上皮囊肿组织(良性组)作对照，分析miR-26b表达与临床病理参数(年龄、临床分期、分化程度、组织类型及淋巴结转移)的关系。将化学合成miR-26b前体分子 mimics 和无关序列转染卵巢癌细胞株HO8910，采用MTT法检测转染 24、48、72、96 h后的细胞增殖情况，采用流式细胞仪PI/Annexin V-FITC双染法及PI单染法检测转染48 h后的细胞凋亡及细胞周期情况。结果 卵巢癌组的miR-26b水平均低于正常组和良性组(P<0.05)，且其表达与临床分期、分化程度及淋巴结转移均有关(P<0.05)。与对照组相比，过表达组(转染miR-26b mimics)的增殖抑制率和凋亡率均升高，且细胞周期中G0/G1期细胞比例升高而S期细胞比例降低(P<0.05)。结论 在卵巢癌细胞中上调miR-26b表达可抑制增殖并诱导凋亡及细胞周期组织，在卵巢癌防治中有一定价值。

卵巢癌；miR-26b

卵巢癌是一种恶性程度较高的妇科肿瘤，发病隐匿且缺乏有效筛查手段，确诊时多为晚期，无法行手术治疗，而常规治疗手段效果不理想〔1〕。深入研究卵巢癌的发病机制和致病基因是目前的当务之急〔2〕。microRNA是一种可在转录后水平调控基因表达的保守非编码RNA,与肿瘤的发生发展及恶性转化关系密切。microRNA-26b(miR-26b)可抑制肿瘤细胞的增殖，且在肝癌、胃癌和乳腺癌组织及细胞中表达下调〔3～5〕，但目前在卵巢癌中的功能尚不清楚。本研究拟首先在卵巢癌组织中观察miR-26b的表达，然后通过转染手段观察过表达其水平对卵巢癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂 人卵巢癌细胞株HO8910购自上海中科院生化细胞所，置于含10%胎牛血清的RPMI1640中常规条件培养。RNA抽提试剂盒Trizol、脂质体试剂Lipofectamine 2000TM购自Invitrogen公司， SYBR qPCR Mix及ROX校正染料购自Fermentas 公司，miR-26b 前体分子 mimics(5′-UGGAUAGGACUUAAUGAACUU-3′)和无关序列(5′-GGCUGACAGCCUUAUCAG-3′)购自美国Applied Biosystems公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司，噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司，膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡双染试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 组织样本 收集2013年1月至2015年12月江西省妇幼保健院病理科存档的72例卵巢癌患者手术切除的上皮性卵巢癌组织标本(卵巢癌组)，均经病理确诊且取样前未行放化疗，年龄31～64岁，中位年龄52.5岁，≤50岁29例，>50岁43例；临床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期17例；组织学类型：浆液性36例，黏液性16例，内膜样13例，透明细胞7例；分化程度：低分化28例，中分化25例，高分化19例；47例有淋巴结转移。选取26例正常卵巢上皮组织(正常组)和45例良性卵巢上皮囊肿组织(良性组)作对照，其中正常组取材于子宫肌瘤或子宫腺肌症等手术同时行附件切除术的卵巢，年龄范围30～63岁，中位年龄53.0岁；良性组的年龄范围33～68岁，中位年龄55.0岁。3组年龄均无统计学差异，具可比性。

1.3 实时定量PCR(qPCR) 将液氮冻存的癌组织及癌旁组织标本，采用TRIzol法提取总RNA，选取符合扩增要求的RNA(OD260/OD280介于1.8～2.0)。

每份RNA样品均取2 μg在M-MLV逆转录酶作用下合成cDNA，以cDNA为模板进行逆转录反应，总体系为20 μl，反应条件为95℃预变性10 min，后按95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40个循环。采用Primer 5.0 软件设计荧光定量PCR引物，其中miR-26b上游：5′-CAAAGGTCCATAGCAAGGGT-3′； 下游：5′-GCGACCTTGTCATGGTTTATAG-3′；内参U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。应用2-△△Ct法计算卵巢癌组和良性组相对于正常组的miR-26b表达量。分析miR-26b表达与卵巢癌临床病理参数(年龄、临床分期、分化程度、组织类型及淋巴结转移)的关系。

1.4 细胞分组及转染 将对数生长期HO8910细胞分为对照组、空转染组和过表达组，对照组不行转染处理；过表达组通过脂质体Lipofectamine 2000包裹miR-26b mimics后瞬时转染HO8910细胞；空转染组转染无关序列，转染24 h后采用qPCR法检测各组细胞的miR-26b以验证转染效果。

1.5 细胞增殖检测 取对数生长期HO8910细胞，以1×104细胞/孔接种于无菌96孔培养板，分组同上，每组设5个复孔，分别取转染24、48、72、96 h后4个时间点，采用微量移液器向每孔各加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后吸取孔内上清，每孔加入DMSO 150 μl，摇床上震荡10 min后在ELX800型自动酶标仪490 nm波长测各组吸光值(A)，根据公式计算实验组相对于对照组的增殖抑制率：增殖抑制率= (1-实验组A值/对照组A值)×100。

1.6 流式细胞仪PI/Annexin V双染法 收集转染后的各组细胞，按1×105个/ml的密度接种培养液中，转染24、48 h后取100 μl细胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC 10 μl和PI 5 μl溶液，避光孵育15 min后FACSCalibur 流式细胞仪检测10 000个细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.7 细胞周期检测 收集各组转染96 h的HO8910细胞，用胰蛋白酶消化细胞，经PBS清洗后用预冷乙醇固定2 h以上，PBS清洗后加入RNase A处理30 min，加入20 g/ml PI溶液，避光反应30 min后上流式细胞仪检测各周期细胞分布。

1.8 统计学分析 采用SPSS18.0软件。计量资料两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 miR-26b在卵巢癌组织中的表达情况 卵巢癌组miR-26b水平(0.247±0.011)低于正常组(1.014±0.009)和良性组(1.102±0.026)(P<0.05)；正常组和良性组miR-26b水平差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 miR-26b水平与卵巢癌临床病理参数的关系 卵巢癌组织中，miR-26b水平与年龄(≤50岁组：0.254±0.019，>50岁组0.242±0.023)及组织学类型(浆液性0.249±0.022，其他：0.245±0.019)均无关(P>0.05)，但与临床分期、分化程度及淋巴结转移均有关(P<0.05)，其中Ⅲ+Ⅳ期(0.154±0.017)、低分化(0.133±2.021)及有淋巴结转移(0.186±0.012)的miR-26b水平均低于相应项(Ⅰ+Ⅱ期：0.351±0.045；高+中分化：0.288±0.027；无淋巴结转移0.361±0.031)(P<0.05)。

2.3 HO8910细胞过表达后的miR-26b水平 过表达组转染96 h后的miR-26b水平(6.114±0.472)高于对照组(1.057±0.024)(P<0.05)，提示在HO8910细胞中成功过表达miR-26b；空转染组的miR-26b水平为(0.991±0.032)，与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 过表达miR-26b对HO8910细胞增殖水平的影响 过表达组转染24～96 h的增殖抑制率均高于其余两组(P<0.05)，其中96 h细胞基本死亡；其余两组增殖抑制率无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.5 过表达miR-26b对HO8910细胞凋亡水平的影响 对照组和空转染组的凋亡率分别为(5.54±0.39)%和(6.13±0.57)%，差异无统计学意义(P>0.05)；过表达组的凋亡率为(33.29±2.64)%，高于其余两组(P<0.05)。

2.6 过表达miR-26b对HO8910细胞周期水平的影响 与其余两组相比，过表达组细胞周期中G0/G1期细胞比例升高而S期细胞比例降低(P<0.05)；对照组和空转染组细胞周期比例无统计学差异(P>0.05)。见表2。

组别24h48h72h96h对照组0000空转染组0.75±0.091.12±0.130.98±0.200.85±0.17过表达组15.49±1.571)2)42.56±2.821)2)72.19±3.651)2)96.19±3.111)2)

与对照组比较:1)P<0.05；与空转染组比较:2)P<0.05；下表同

组别G0/G1SG2/M对照组45.61±2.7537.28±2.6219.13±1.35空转染组47.33±2.9236.95±3.1920.48±1.76过表达组71.42±3.401)2)18.19±1.781)2)21.67±2.121)2)

3 讨 论

miRNAs在肿瘤调控中主要以癌基因或抑癌基因的形式发挥作用，但miRNA对肿瘤的调控模式研究仍处于初步阶段〔6,7〕。针对卵巢癌发生发展中起关键作用的miRNA进行研究有重要临床价值。miR-26b在多种肿瘤组织中异常表达，且在不同肿瘤中扮演着癌基因或抑癌基因的角色〔8,9〕，提示miR-26b具有肿瘤特异性。本研究提示miR-26b在卵巢癌发生发展中发挥抑癌基因的作用。进一步研究发现，miR-26b水平与临床分期、分化程度及淋巴结转移均有关，其中肿瘤恶性程度越高时(如临床分期越晚、分化程度越低)miR-26b水平越低，以上结果表明miR-26b在卵巢癌中发挥抑癌基因的作用，推测miR-26b水平降低可能与其表达受抑制有关。

为进一步验证miR-26b的功能，本研究选取常见的HO8910细胞通过转染前体mimics，在转染24 h后即可发现miR-26b水平大幅升高，表明HO8910细胞成功过表达miR-26b，具有较好的方法学基础。过表达miR-26b后HO8910细胞的增殖抑制率升高，表明过表达miR-26b可抑制HO8910细胞增殖，此外过表达miR-26b可诱导细胞凋亡及细胞周期G0/G1期阻滞，更好地说明miR-26b具有抑癌基因的效果。miR-26b可抑制卵巢癌细胞的恶性行为可能与其调控的靶基因有关，如马德亮等〔10〕的研究发现miR-26b可靶向抑制Wnt信号通路中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表达，负性参与乳腺癌细胞的干性调节，而叶劲军等〔11〕发现miR-26b能与MDM2 3′UTR 特异结合，并调控P53/MDM2通路影响胃癌细胞的增殖及凋亡。

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10 马德亮,秦 静,张佃富,等.miR-26b靶向GSK-3β发挥抗乳腺癌细胞干性的作用研究〔J〕.临床肿瘤学杂志,2015;20(12):1068-73.

11 叶劲军,周国仁,张 治,等.miR-26a/b调控p53/MDM2通路对胃癌细胞凋亡的影响〔J〕.临床肿瘤学杂志,2015;20(11):972-6.

〔2016-04-15修回〕

(编辑 徐 杰)

国家自然科学基金(81302304)

陈 诚(1975-)，男，副主任技师，主要从事临床检验研究。

R739

A

1005-9202(2017)01-0015-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.006

1 江西省妇幼保健院 2 南京医科大学附属南京市妇幼保健院医学研究中心