西红花苷对急性高海拔低氧条件大鼠脑海马P53 表达及凋亡的影响

张晓岩 张先钧 贾 炜 蒲小燕 王海燕 梁 宏 李凤辉 张 杰

(青海大学医学院，青海 西宁 810016)

·基础研究·

西红花苷对急性高海拔低氧条件大鼠脑海马P53 表达及凋亡的影响

张晓岩 张先钧 贾 炜 蒲小燕 王海燕 梁 宏 李凤辉 张 杰

(青海大学医学院，青海 西宁 810016)

目的 探讨西红花苷提前用药对急性高海拔低氧条件下大鼠脑海马神经细胞凋亡及P53表达的影响。方法 SD大鼠随机分为低氧对照组和低氧用药组，用药组每天肌肉注射西红花苷(50 mg/kg)，对照组每天肌肉注射相同剂量的 0.9% NaCl，连续给药3 d后运至海拔4 200 m，在第1、3、5、7天取材。TUNEL 法检测大鼠脑海马CA1区细胞凋亡，通过RT-PCR 方法检测脑海马P53 mRNA 水平，通过Western印迹法检测P53蛋白水平。结果 与低氧对照组相比，用药组大鼠脑海马细胞凋亡率在第1、3、5、7天明显降低(P<0.05)；P53 mRNA及蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。结论 西红花苷能通过下调急性高海拔低氧条件下大鼠脑海马 P53的表达、降低脑海马细胞的凋亡率达到保护脑海马神经元的作用。

西红花苷;低氧;P53;凋亡

急性低氧条件常引起不可逆的中枢神经系统损伤〔1〕，因此，利用药物干预保护急性低氧条件下脑神经是高原脑病研究的主要方向之一。藏红花为鸢尾科植物番红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头,传统医学研究认为其性平、味甘,归心、肝经,具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神、抗抑郁等功效,《本草品汇精要》记载“主散郁调血，宽胸膈，开胃进食，久服滋下元，悦颜色，及治伤寒发狂”。西红花苷(Crocin)是藏红花主要有效成分可以抑制脑海马β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡〔2〕、抗氧化，治疗脑梗死，对神经变性损坏和缺血性脑损伤有保护作用，改善学习记忆障碍等〔3，4〕。然而，西红花苷调控急性低氧条件下脑海马细胞凋亡的具体分子机制并不十分清楚。本实验初步探讨西红花苷抑制急性低氧条件下脑海马凋亡的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠，体重约180～200 g,北京大学实验动物中心提供，许可证编号SCXK(京)2011-0012。在动物房中适应环境1 w后开始进行实验。

1.2 药品与试剂 西红花苷(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO.,LTD.)；dUTP击知末端标记测定法(TUNEL)试剂盒(Promega公司)，乌拉坦(Adamas Reagent Co.,Ltd.)；小鼠抗大鼠β-actin一抗(Abcam)；小鼠抗大鼠P53一抗(Abcam)；山羊抗小鼠二抗及辣根过氧化物酶显色试剂盒(武汉博士德)；总RNA提取试剂盒；DNA Marker I、琼脂糖(TIANGEN)。β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′,下游引物5′-CAACACAGCCTGGATGGCTA-3′(480 bp)；P53上游引物5′-AAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3′,下游引物5′-CGTCACCATCAGAGCAACG-3′(372 bp)，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 仪器 CX31-32C02奥林巴斯光学显微镜，PM-20 型全自动显微摄影仪，DYCZ-24DN型双垂直电泳槽，DYY-7C型电泳仪，5418R高速离心机，TC-XP-G基因扩增仪等。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及取材 雄性SD大鼠96只，随机分为低氧对照组、低氧用药组。低氧用药组每天肌肉注射西红花苷一次(50 mg/kg)〔5〕，低氧对照组每天肌肉注射相同体积的0.9%NaCl，连续给药3 d后运至高海拔低氧环境(青海省果洛州甘德县,海拔4 200 m)。第1、3、5、7天取材，25%乌拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,断头处死，快速取出全脑冰上剥离海马，置于液氮中保存。

1.4.2 TUNEL 法检测脑海马细胞凋亡 按TUNEL检测试剂盒说明操作。取各组大鼠脑海马常规固定、脱水、石蜡包埋、切片。切片脱蜡至水，然后室温0.85% NaCl 冲洗5 min;磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min，接着蛋白酶 K(20 μg/ml)消化30 min(37℃)，PBS 冲洗5 min;而后缓冲液室温下处理5 min，加入100 μl TUNEL 反应混合液于37℃孵育60 min，PBS 冲洗，然后加入柠檬酸缓冲液(SSC)终止反应。PBS 冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精轻度复染，光镜下观察细胞核呈棕褐色染色的细胞为TUNEL染色阳性细胞，在400倍下观察5个不连续的视野。采用Image Pro Plus 4.5 图像分析软件进行凋亡细胞计数。

1.4.3 RT-PCR检测 按照总RNA提取试剂盒说明书步骤提取大鼠海马组织RNA,测RNA浓度；然后按反转录试剂盒说明书步骤进行实验，测DNA浓度。进而进行PCR扩增。PCR反应体系：模板2 μg,引物各1 μl，Mix 25 μl，用ddH2O补至50 μl。PCR体系反应条件：95℃ 5 min,95℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min,4℃ 1 h，30个循环。凝胶电泳条件：2%琼脂糖凝胶，1×TAE电泳液，5 μl样品上样量，3 μl MarkerⅠ上样量，电压100 V，电泳时间35 min。取出凝胶，用BIO-RAD凝胶成像仪成像拍摄图片，用Quantity one 软件检测P53与β-actin相对表达量。

1.4.4 Western印迹法检测P53蛋白表达 提取大鼠脑海马组织蛋白，用BCA法测定蛋白量。取30 μl蛋白样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转移1.5 h至硝酸纤维素膜(NC)上，5%脱脂奶粉封闭2 h后与1∶500稀释的小鼠抗大鼠β-actin一抗，1∶100稀释的小鼠抗大鼠P53一抗于4 ℃过夜，与1∶1 000稀释的二抗室温孵育30 min，再与化学发光剂(ECL)室温作用1 min，曝光、显影和定影。胶片扫描后，采用Quantity One软件对显影条带进行分析，以目的条带与β-actin条带灰度的比值作为蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0软件行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1 TUNEL法检测脑海马细胞凋亡 低氧用药组凋亡率在第1、3、5、7天明显低于低氧对照组(P<0.05)。低氧对照组凋亡率于第1、3、5天高表达；第7天有所下降且与组内其他时间比较有统计学意义(P<0.05)。低氧用药组凋亡率在第1、3、5、7天逐渐升高但仍然低于低氧对照组(P<0.05)。见图1，表1。

图1 TUNEL 法检测各组大鼠海马CA1区凋亡细胞结果(↑凋亡细胞，×400)

组别1d3d5d7d低氧对照组12.65±0.911)15.90±2.191)18.72±1.141)10.18±0.681)低氧用药组2.32±0.781)4.90±1.141)7.05±0.821)8.98±0.671)t/P值-19.21/0.00-9.97/0.00-18.47/0.00-2.77/0.02

与同组其他时间比较：1)P<0.05；下表同

2.2 RT-PCR结果 低氧用药组相对表达量在第1、3、5、7天明显低于低氧对照组(P<0.05)。低氧对照组P53 mRNA的相对表达量于第1、3天、5天高表达，第7天有所下降且与组内其他组比较有统计学意义(P<0.05)。低氧用药组P53 mRNA的相对表达量在第1、3、5、7天逐渐升高但仍然低于低氧组(P<0.05)。见图2，表2。

2.3 Western印迹检测P53蛋白表达结果 低氧用药组相对表达量在第1、3、5、7天明显高于低氧对照相(P<0.05)。低氧对照组P53蛋白的表达量于第1、3、5天逐渐升高，第7天有所下降(P<0.05)；低氧用药组P53蛋白的表达量在第1、3、5、7呈逐渐上升趋势且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3，表2。

图2 各组大鼠海马P53 mRNA的表达

图3 Western印迹检测各组P53蛋白的表达

组别P53/β-actinmRNA1d3d5d7dP53/β-actin蛋白1d3d5d7d低氧对照组0.27±0.021)0.34±0.021)0.31±0.031)0.20±0.011)0.32±0.021)0.35±0.021)0.40±0.021)0.28±0.011)低氧用药组0.07±0.021)0.12±0.011)0.16±0.011)0.18±0.011)0.06±0.011)0.13±0.011)0.21±0.021)0.25±0.011)t/P值-30.40/0.00-33.28/0.00-15.25/0.00-3.74/0.00-34.92/0.00-28.35/0.00-21.14/0.09-5.45/0.00

3 讨 论

西红花作为传统中藏药材，其活性成分西红花苷具有抗氧化、增强神经元活性等作用，具有治疗神经变性损坏、抑制神经元凋亡〔6，7〕等诸多疗效。神经系统在高海拔低氧的特殊环境中形态结构及功能将会发生很大的变化，而海马神经细胞极易受到低氧环境的损伤。本实验说明，在高海拔急性低氧环境中西红花苷能明显改善脑海马神经元凋亡，达到急性低氧条件下的神经保护作用。

P53是最常见的促凋亡基因之一，P53及其相关基因在脑组织中的表达调控已成为缺血缺氧神经元死亡机制中的一个关键性环节。急性低氧脑病病因是大脑急性缺氧，海马是缺氧性脑损伤中最敏感的脑区，海马存在明显的细胞凋亡，因此认为，检测大鼠海马组织中P53蛋白的表达情况可作为反映脑缺血大鼠脑组织神经元凋亡的间接指标。P53是神经元损伤后主要的调节因子，P53可转移至线粒体内和 Bcl-2家族相互作用，促进 Bax和抑制Bcl-2的表达，引起蛋白底物的降解导致细胞色素C 释放，从而激活相关caspase引起凋亡〔8，9〕。西红花苷提前用药干预可抑制P53表达，显著下调P53促凋亡基因，对高海拔低氧条件下脑海马神经元有保护作用，明显抑制海马神经元脑神经细胞凋亡的发生及抗低氧损伤和修复功能，说明西红花苷通过下调P53对急性低氧条件下脑海马神经元有明显的保护作用。下调P53促凋亡基因的可能机制与西红花苷抑制神经元细胞凋亡、对抗神经细胞损伤、增强免疫等有关 。因而，P53在急性低氧诱导凋亡的过程中发挥重要的调控作用。所以，抑制低氧性脑损伤导致神经元细胞的凋亡、增强海马神经元抗缺氧及抗自由基损伤的能力、改善脑缺氧状态，可能是西红花苷作用机制之一。

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2 Asadi F,Jamshidi AH,Khodagholi F,etal.Reversal effects of crocin on amyloid β-induced memory deficit:modification of autophagy or apoptosis markers〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,2015;139(Pt A):47-58.

3 Rajaei Z,Hosseini M,Alaei H.Effects of crocin on brain oxidative damage and aversive memory in a 6-OHDA model of Parkinson′s disease〔J〕.Arq Neuropsiquiatr,2016;74(9):723-9.

4 Sarshoori JR,Asadi MH,Mohammadi MT.Neuroprotective effects of crocin on the histopathological alterations following brain ischemia-reperfusion injury in rat〔J〕.Iran J Basic Med Sci,2014;17(11):895-902.

5 张晓岩，喻 静，张先钧，等.西红花苷-1 对急性低氧条件下大鼠学习记忆及海马 SIRT1 表达的影响〔J〕.中草药,2013;44(10):1314-7.

6 Ochiai T,Shimeno H,Mishima K,etal.Protective effects of carotenoids from saffron on neuronal injury in vitro and in vivo〔J〕.Biochim Biophys Acta,2007;1770(4):578-84.

7 Chen L,Qi Y,Yang X.Neuroprotective effects of crocin against oxidative stress induced by ischemia/reperfusion injury in rat retina〔J〕.Ophthalmic Res,2015;54(3):157-68.

8 Endo H,Kamada H,Nito C,etal.Mitochondrial translocation of p53 mediates release of cytochrome c and hippocampal CA1 neuronal death after transient global cerebral ischemia in rats〔J〕.J Neurosci,2006;26(30):7974-83.

9 Murase S,Poser SW,Joseph J,etal.p53 controls neuronal death in the CA3 region of the newborn mouse hippocampus〔J〕.Eur J Neurosci,2011;34(3):374-81.

〔2016-07-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

Effect of crocin on expression of P53 and apoptosis in hippocampus under hypoxia at high altitude in rats

ZHANG Xiao-Yan，ZANG Xian-Jun， JIA Wei，et al.

Qinghai University Medical College，Xining 810016，Qinghai，China

Objective To observe the effect of crocin in advance of the medication on the apoptosis and P53 expression in hippocampus under hypoxia at high altitude in rats.Methods SD rats were randomly divided into hypoxia control and hypoxia treatment groups． The SD rats in treatment group were injected Crocin once daily(50 mg·kg-1·d-1) and the model group were injected the same dose of 0.9% Nacl for 3 days，and then they were shifted to high altitude 4 200 m and then the samples were taken at 1 d，3 d，5 d，7 d. The apoptosis of nerve cells was determined by TUNEL. P53 protein was detected by Western blot and mRNA was detected by RT-PCR.Results Compared with the control group， treatment group showed significantly lower in the apoptosis rate at 1，3，5，7 d(P<0.05). The results of RT-PCR showed that P53 mRNA in hippocampus of rats was lower in treatment group than that of control group at 1, 3, 5,7 d (P<0.05). Western blot showed that P53 protein in hippocampus of rats was obviously lower in treatment group than that of control group at 1,3, 5, 7 d (P<0.05).Conclusions Crocin pretreatment could reduce the expression of P53 and the apoptosis in hippocampus at acute high altitude hypoxia conditions，and protect the nerve cells in hippocampus and ameliorate the nerve function by regulating the P53 signal.

Crocin; Hypoxia;P53;Apoptosis

国家自然科学基金项目(No.81260685)；青海省科技厅“基础研究”项目(No.2016-ZJ-708)

张晓岩(1974-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事低氧环境脑神经的保护研究。

R282.7

A

1005-9202(2017)01-0001-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.001