Rab5A在结直肠癌中的表达及其意义*

崔 荣 唐骁文 石兴耀 周 勇

上海市嘉定区中医医院外科(201800)

Rab5A在结直肠癌中的表达及其意义*

崔 荣 唐骁文 石兴耀#周 勇

上海市嘉定区中医医院外科(201800)

背景：结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已为进展期，预后较差，早期诊断对改善患者预后尤为重要。目前，分子标记物诊断结直肠癌备受关注。目的：探讨Rab5A在结直肠癌中的表达及其意义。方法：收集135例行结直肠癌切除术患者的癌组织及其配对癌旁非癌组织。采用real-time PCR检测21例患者癌组织及其配对癌旁非癌组织以及结肠癌细胞株HCT116、HT-29、LoVo、SW480和正常结肠上皮细胞株NCM460中的Rab5A mRNA表达；采用蛋白质印迹法检测4例患者癌组织及其配对癌旁非癌组织中的Rab5A蛋白表达；采用免疫组化法检测110例患者癌组织中的Rab5A蛋白表达；分析Rab5A表达与结直肠癌临床病理特征和预后的关系。结果：结直肠癌组织中的Rab5A mRNA表达水平显著高于癌旁非癌组织(P=0.003)；结肠癌细胞株HCT116、HT-29、LoVo、SW480中的Rab5A mRNA表达水平显著高于正常结肠上皮细胞株NCM460(P<0.05)。结直肠癌组织中的Rab5A蛋白表达水平显著高于癌旁非癌组织。110例结直肠癌组织中，51例(46.4%)为Rab5A低表达，59例(53.6%)为Rab5A高表达。Rab5A蛋白表达与肿瘤大小、血清癌胚抗原(CEA)水平和TNM分期相关(P=0.008；P=0.002；P=0.010)。Rab5A高表达患者的3年生存率显著低于低表达者(52.1%对77.5%，P<0.05)。Rab5A、血清CEA和TNM分期与结直肠癌患者的预后相关(P=0.009；P=0.006；P=0.017)，是影响预后的独立因素(P=0.026；P=0.032；P=0.014)。结论：Rab5A参与了结直肠癌的恶性演进过程，其高表达提示患者预后不良，可作为预测结直肠癌患者预后的有效指标。

结直肠肿瘤； Rab5A； 免疫组织化学； 预后

结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一。早期结直肠癌患者无明显症状，或仅表现为非特异性消化道症状，多数患者确诊时已为进展期，预后较差，早期诊断对改善患者预后尤为重要[1-4]。结肠镜是诊断结直肠癌的金标准，但为侵入性，患者耐受性差，不适用于人群筛查。因此，亟待探寻可有效诊断早期结直肠癌的非侵入性检查方法，其中分子标记物备受关注。

Rab5属于Rab GTP酶(GTPases)家族成员，包含3种亚型，分别为Rab5A、Rab5B和Rab5C[5-6]。Rab5A在多种肿瘤(如乳腺癌、肺癌、卵巢癌)中表达异常，可促进肿瘤发生以及远处转移，在肿瘤的发病机制中发挥至关重要的作用[7-10]。然而，目前尚未见关于Rab5A在结直肠癌中作用的报道。本研究通过检测Rab5A在结直肠癌组织中的表达并分析其表达与患者临床病理特征和预后的相关性，旨在明确Rab5A在结直肠癌发生、发展中的作用。

材料与方法

一、研究对象

纳入2005年1月—2015年6月于上海市嘉定区中医医院行结直肠癌切除术的患者135例，其中男80例，女55例，年龄30～83岁，平均(65.65±0.95)岁。所有患者术前均未接受放化疗。采集患者术后癌组织及其配对癌旁非癌组织(距癌组织边缘5 cm)标本。所有标本经HE染色后由组织病理学检查确诊。研究方案经上海市嘉定区中医医院医学伦理委员会审批，入选患者或其家属签署知情同意书。

二、细胞株和主要试剂

结肠癌细胞株HCT116、HT-29、LoVo、SW480以及正常结肠上皮细胞株NCM460(上海交通大学医学院附属仁济医院中心实验室提供)，以含10%胎牛血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)或含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12培养基(美国Hyclone公司)培养(37 ℃，5% CO2)。RNA提取试剂、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]，BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Rab5A抗体(美国Abcam公司)， 二抗(美国Proteintech公司)，ECL化学发光试剂盒(美国Millipore公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：取21例患者的癌组织及其配对癌旁非癌组织标本、结肠癌细胞株HCT116、HT-29、LoVo、SW480和正常结肠上皮细胞株NCM460，采用RNA提取试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，行real-time PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。Rab5A引物上游：5’-ACG GGC CAA ATA CGG GAA AT-3’，下游：5’-TCA AAC TTT ACC CCA ATG GTA CTC-3’；GAPDH引物上游：5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’，下游：5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。以2-△△Ct法分析目的基因相对表达量。

2. 蛋白质印迹法：取4例患者的癌组织及其配对癌旁非癌组织标本，蛋白裂解液裂解，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白质转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，加入Rab5A抗体(1∶200稀释)，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜，加入HRP标记的二抗(1∶4 000 稀释)，室温孵育1 h。ECL显影，ImageJ图像分析软件行灰度扫描，分析目的蛋白相对表达量。

3. 免疫组化染色：取110例患者的癌组织标本，常规石蜡包埋，切片，脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢孵育15 min，微波修复15 min，自然冷却后以10%胎牛血清白蛋白封闭30 min，加入Rab5A抗体(1∶200稀释)，4 ℃过夜，加入HRP标记的二抗(1∶4 000 稀释)孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。Rab5A蛋白表达定位于细胞质，胞质呈明显棕黄色或棕褐色染色判定为Rab5A阳性。每张切片于高倍镜下随机选取10个视野，计数1 000 个肿瘤细胞中的阳性细胞数。阳性细胞百分率：<1%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分；>51%，3分。染色强度：未着色或与背景色相似，0分；着色浅，略高于背景色，1分；中等着色，明显高于背景色而呈棕黄色，2分；强染呈棕褐色，3分。总分为阳性细胞百分率与染色强度评分的乘积，<4分为Rab5A低表达；≥ 4分为Rab5A高表达。

4. 随访情况：对本组患者进行随访，随访截至2015年12月31日，随访时间6～120个月，中位随访期36个月。随访方式为电话或门诊随访。

四、统计学分析

结 果

一、Rab5A mRNA表达情况

Real-time PCR检测结果显示，结直肠癌组织中的Rab5A mRNA表达水平显著高于癌旁非癌组织(P=0.003)(图1)；结肠癌细胞株HCT116、HT-29、LoVo、SW480中的Rab5A mRNA表达水平显著高于正常结肠上皮细胞株NCM460(P<0.05)(图2)。

图1 结直肠癌及其配对癌旁非癌组织中Rab5A mRNA表达 情况

二、Rab5A蛋白表达情况

蛋白质印迹法检测结果显示，结直肠癌组织中的Rab5A蛋白表达水平显著高于癌旁非癌组织(图3)。

三、Rab5A表达与结直肠癌临床病理特征的关系

免疫组化染色结果显示，110例结直肠癌组织中51例(46.4%)为Rab5A低表达，59例(53.6%)为Rab5A高表达(图4)。

图2 结肠癌细胞株和正常结肠上皮细胞株Rab5A mRNA表达情况

图3 Rab5A蛋白在结直肠癌(T)及其配对癌旁非癌组织(N)中的表达情况(蛋白质印迹法)

A： Rab5A低表达；B： Rab5A高表达

图4 结直肠癌组织中Rab5A蛋白表达情况(免疫组化染色，×100)

采集患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、血清癌胚抗原(CEA)水平、TNM分期数据，分析其与癌组织中Rab5A蛋白表达的关系，结果显示Rab5A蛋白表达与肿瘤大小、血清CEA水平和TNM分期相关(P=0.008；P=0.002；P=0.010)， 与患者性别、年龄、肿瘤部位无关(P>0.05)(表1)。

四、Rab5A表达与结直肠癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示，Rab5A高表达患者和低表达患者的3年生存率分别为52.1%和77.5%，高表达者显著低于低表达者(P<0.05)(图5)。

表1 结直肠癌组织Rab5A蛋白表达与患者临床病理特征的关系

临床病理特征例数Rab5An(%)低表达(n=51)高表达(n=59)P值性别 男6226(41.9)36(58.1)0.223 女4825(52.1)23(47.9)年龄 ≤65岁4116(39.0)25(61.0)0.876 >65岁6935(50.7)34(49.3)肿瘤大小 ≤5cm5732(56.1)25(43.9)0.008 >5cm5319(35.8)34(64.2)肿瘤部位 直肠7932(40.5)47(59.5)0.941 结肠3119(61.3)12(38.7)血清CEA ≤5ng/mL5831(53.4)27(46.6)0.002 >5ng/mL5220(38.5)32(61.5)TNM分期 Ⅰ-Ⅱ4226(61.9)16(38.1)0.010 Ⅲ-Ⅳ6825(36.8)43(63.2)

图5 Rab5A蛋白表达与结直肠癌患者预后的关系(Kaplan-Meier法)

Kaplan-Meier单因素模型分析表明，Rab5A、血清CEA和TNM分期与结直肠癌患者的预后相关(P=0.009；P=0.006；P=0.017)。进一步行Cox比例风险回归模型分析，结果显示Rab5A、血清CEA和TNM分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素(P=0.026；P=0.032；P=0.014)(表2)。

表2 结直肠癌患者预后影响因素分析

讨 论

研究表明，Rab家族在肿瘤发生、发展过程中扮演重要角色。Rab25可通过激活Akt/GSK-3β信号通路介导上皮-间质转化，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[11-12]，可作为卵巢癌患者的独立预后预测指标，与淋巴结转移密切相关[13]。Rab3D可通过调节热休克蛋白90(Hsp90)促进乳腺癌的上皮-间质转化，进而导致肿瘤细胞迁移、侵袭[14]。Rab27A可通过调控胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)影响血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)以及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等的表达，从而促进乳腺癌细胞侵袭和转移[15]，亦可作为结直肠癌和胰腺癌患者预后的独立预测指标[16-17]。

作为Rab家族成员之一，Rab5A亦在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[18]。Fukui等[19]的研究显示，Rab5A可通过EGF信号通路促进肝细胞癌转移。Yang等[8]的研究发现，Rab5A与乳腺癌腋窝淋巴结转移密切相关。Zhao等[10]对卵巢癌的研究表明，Rab5A可促进G1期肿瘤细胞向S期转化。

本研究检测了Rab5A在结直肠癌组织和细胞株中的表达情况， 结果显示结直肠癌组织中Rab5A mRNA和蛋白表达水平均明显高于癌旁非癌组织，结肠癌细胞株中的Rab5A表达亦明显上调；110例结直肠癌组织中59例(53.6%)为Rab5A高表达。上述结果表明Rab5A在转录和转录后水平呈高表达，可作为结直肠癌的分子标记物。

进一步分析Rab5A表达与结直肠癌临床病理特征的关系，结果显示Rab5A蛋白表达水平与肿瘤大小、血清CEA水平和TNM分期相关，随着肿瘤体积的增大和恶性程度的增高，Rab5A蛋白阳性表达率明显升高，提示其参与了肿瘤的恶性演进过程。Kaplan-Meier生存分析表明Rab5A蛋白高表达患者的3年生存率显著低于低表达者；单因素分析表明，Rab5A蛋白表达水平与结直肠癌患者的预后密切相关；多因素分析表明，Rab5A表达水平是影响预后的独立因素。

综上所述，本研究结果表明，Rab5A 在结直肠癌组织中呈高表达，其表达水平越高，患者预后越差，可作为预测结直肠癌患者预后的有效指标。然而，Rab5A在结直肠癌恶性演进过程中的具体作用机制仍未完全明确，有待后续进一步深入研究。

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(2016-05-14收稿；2016-07-28修回)

Expression and Significance of Rab5A in Colorectal Cancer

CUIRong,TANGXiaowen,SHIXingyao,ZHOUYong.

DepartmentofGeneralSurgery,JiadingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Shanghai(201800)

SHI Xingyao, Email: drcuirong@hotmail.com

Colorectal Neoplasms; Rab5A; Immunohistochemistry; Prognosis

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.01.003

上海市嘉定区科学技术委员会资助课题(2015014)

#本文通信作者，Email: drcuirong@hotmail.com

Background: Colorectal cancer is one of the commonly seen malignant tumors in digestive system. Most patients with colorectal cancer were diagnosed in advanced stage and the prognosis is poor. Early diagnosis is crucial to improve the overall survival of patient. Currently, molecular markers for diagnosis of colorectal cancer has attracted more and more attention of the investigators. Aims: To investigate the expression and significance of Rab5A in colorectal cancer. Methods: Colorectal cancerous tissue and the paired para-cancer noncancerous tissue of 135 patients who underwent resection for colorectal cancer were collected. Expression of Rab5A mRNA in cancerous tissue, para-cancer noncancerous tissue, colon cancer cell lines HCT116, HT-29, LoVo and SW480 and normal colonic epithelial cell line NCM460 was determined by real-time PCR. Protein expression of Rab5A in cancerous tissue and para-cancer noncancerous tissue of 4 patients was detected by Western blotting. Protein expression of Rab5A in cancerous tissue of 110 patients was detected by immunohistochemistry. Correlations between expression of Rab5A and clinicopathological characteristics and prognosis of colorectal cancer were analyzed. Results: Expression of Rab5A mRNA in cancerous tissue was significantly higher than that in para-cancer noncancerous tissue (P=0.003). Expression of Rab5A mRNA in colon cancer cell lines HCT116, HT-29, LoVo and SW480 was significantly higher than that in normal colonic epithelial cell line NCM460 (P<0.05). Protein expression of Rab5A in cancerous tissue was significantly higher than that in para-cancer noncancerous tissue. In 110 cancerous tissues, 51 (46.4%) had low expression of Rab5A and 59 (53.6%) had high expression of Rab5A. Protein expression of Rab5A was significantly correlated with tumor size, serum carcinoembryonic antigen (CEA) level and TNM stage (P=0.008;P=0.002;P=0.010). 3-year survival rate of patients with high Rab5A expression was significantly lower than that of patients with low Rab5A expression (52.1%vs.77.5%,P<0.05). Rab5A protein expression, serum CEA level and TNM stage were correlated with the prognosis of patients with colorectal cancer (P=0.009;P=0.006;P=0.017) and were independent factors for prognosis (P=0.026;P=0.032;P=0.014). Conclusions: Expression of Rab5A correlates with the malignant behavior of colorectal cancer and its high expression indicates a poor prognosis. Rab5A might be used as a predictor for prognosis of colorectal cancer.