食管癌相关基因4(ECRG4)在肝细胞肝癌组织中表达及临床意义

黄 琴

食管癌相关基因4(ECRG4)在肝细胞肝癌组织中表达及临床意义

黄 琴

目的 分析ECRG4基因在肝细胞肝癌组织(HCC)中的表达与甲基化情况，并探讨其临床意义。方法 分别采用免疫组化法、MSP-PCR两种方法，检测50例肝癌组织、对应癌旁组织及31例正常肝组织中的ECRG4蛋白的表达和ECRG4启动子区甲基化情况，并探讨两者之间的相关性。结果 ECRG4蛋白在肝癌组织、癌旁肝组织中表达水平显著低于正常肝组织(P<0.05)，在肝癌组织中表达水平显著低于癌旁肝组织(P<0.05)；且ECRG4肝癌组织的甲基化检出率明显高于癌旁肝组织及正常肝组织(P<0.05)。ECRG4蛋白低表达率与ECRG4甲基化检出率明显相关(P均<0.05)。结论 ECRG4 在HCC组织中表达下调与其启动子区高甲基化存在明显的关联性，在肝癌的发生中发挥重要作用。

肝肿瘤;基因,ECRG4;肿瘤转移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:034～036)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)威胁全世界人民的的常见恶性肿瘤之一。目前国内关于ECRG4基因在HCC方面的研究尚未见报道，因此本研究采用应用免疫组织化学技术检测ECRG4蛋白的表达情况；并采用甲基化特异性 PCR(methylation specific-PCR，MSP-PCR)检测HCC组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况，探讨 ECRG4 在HCC中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究中50例HCC患者均为我院2012年至2015年收治的，手术前均未做放疗和化疗，以术后组织病理学结果明确肿瘤类型。年龄29～70岁,男性36例,女性14例，高分化癌18例，低分化癌32例；FIGO分期标准:Ⅰ期8例，Ⅱ期4例，Ⅲ期30例，Ⅵ期8例；使用组织标本为手术切除的HCC癌组织和癌旁2 cm以外的正常食管粘膜上皮，石蜡包埋、切片，常规脱蜡水化。

1.2 主要试剂及仪器

石蜡组织 DNA 提取试剂盒(GTpureTM)来自上海基因科技公司；抗ECRG4的多克隆抗体及PV9000 试剂购自美国Zymed公司，一抗浓度为1∶100。蛋白酶 K 和 DNA marker DL2000购自大连Takara公司；Wizard DNA cleanup 树脂纯化试剂盒购自 Promega 公司；其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 免疫组化检测

将常规脱蜡水化的标本切片PBS 漂洗 3 次(3 min/次)，3% H2O2室温孵育 10～20 min后再PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)。然后浸于预热的含0.01 M枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的修复盒中加热 20 min分钟，自然冷却后PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)。滴加抗 ECRG4 蛋白一抗，保持4 ℃孵育一夜。PBS 溶液漂洗 3 次(3 min/次)后加入PV9000试剂，室温 20～25 min，PBS 溶液漂洗 3 次再加试剂2抗，37 ℃约30 min。镜下观察DAB溶液的显色反应，直至充分显色后停止。然后用苏木精进行复染，持续5～10 s，并分别用不同浓度(70%、85%、100%)的乙醇脱水3 min，最后浸于二甲苯 10 min后封片。结果评定：0 分：组织未见染色；1分：染色程度均呈现轻度染色或呈现为中强度但染色细胞比例<25%；2 分：染色程度均中度染色或染色细胞比率达25%～50%；3 分：细胞染色程度深者>50%。并采用正常组织评分分别减去癌组织评分、癌旁组织评分的差值来判定是否存在ECRG4 蛋白低表达，差值<0则为无低表达(阴性)，差值=1 则弱低表达(阳性)，差值>1则为低表达明显(强阳性)。

1.4 甲基化特异性 PCR

①DNA提取及亚硫酸氢盐修饰/纯化：按照说明书操作，采用GTpureTM组织 DNA提取试剂盒提取石蜡组织标本基因组 DNA，以 EpiTect Kit 进行提取样本的亚硫酸氢盐修饰与纯化，并于-20℃条件下保存。

②引物设计及合成：采用 MethPrimer 软件根据ECRG4 基因序列分别进行特异引物的设计，具体如下。甲基化引物：上游序列MF：5′-GTTTTGGAGTTTAGGGGTTGC-3′；下游序列MR：5′-AAAAAAATACGAACGAACAAACG-3′；大小 180bp。非甲基化引物：上游序列UF：5′-G-TTTTGGAGTTTAGGGGTTGTG-3′；下游序列 UR：5′-AAAAAAAATACAAACAAACAAACAC-3′；大小 170 bp。

③ECRG4基因扩增：纯化DNA作为模板，采用MSP-PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃下预变性8 min；95 ℃变性 50 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共35个循环。

④判定标准。甲基化阳性：用甲基化引物扩增出目的条带，分为完全甲基化(仅有甲基化引物扩增出相应片段)和不完全甲基化(甲基化引物与非甲基化引物均扩增出相应片段)；甲基化阴性：仅用非甲基化引物扩增出目的条带。甲基化和非甲基化的特异性引物均可扩增出相应的目标基因片段，无其他条带干扰，说明该技术较可靠。

1.5 统计学分析

应用SPSS 19.0软件完成数据整理及统计分析工作。根据数据具体的适用条件选用检验或四格表精确检验行定量资料的组间比较(独立的两两比较)，P<0.05则差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组织中 ECRG4 基因表达情况

HCC癌组织、癌旁组织、正常组织中ECRG4蛋白低表达率分别为78.00%(40/50)和44.00%(28/50)、9.68%(3/28)，肝癌组织、癌旁组织中ECRG4蛋白低表达率均明显高于正常组织的，肝癌组织ECRG4蛋白低表达率高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 HCC组织中 ECRG4 蛋白表达情况比较/例

2.2 HCC组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况

肝癌组织、癌旁组织、正常组织中ECRG4 基因甲基化检出率分别为 58.0%(29/50)、32.0%(16/50)和3.2%(1/31)， 肝癌组织、癌旁组织均明显高于正常组织，肝癌组织 ECRG4 甲基化的检出率高于癌旁组织，且差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 HCC组织中 ECRG4 基因启动子区的甲基化情况/例

2.3 ECRG4 基因表达及启动子区异常甲基化与HCC临床特征的相关性

癌组织中ECRG4 基因甲基化与其低表达百分率呈明显正相关性(γ=0.823，P=0.008)；癌旁组织中ECRG4基因甲基化与其低表达百分率呈正相关性(γ=0.597，P=0.044)；癌旁组织中ECRG4基因甲基化与其低表达百分率无相关性(γ=0.140，P=0.309)。

3 讨论

肝细胞肝癌(HCC)是1类发病率较高的恶性肿瘤，且HCC基因组表现出复杂性及多样性，因此，为了HCC的早期诊断、预后判断及靶向性治疗，加大对HCC中基因表达及基因改变的研究具有重要的理论及临床意义[1]。目前，有关抑癌基因的研究早已成为分子生物学和肿瘤遗传学领域的研究热点。近年来最新发现的定位于正常人体染色体 2q14.1～14.3、具有抑癌基因特征的ECRG4 基因得到许多肿瘤遗传学专家的关注。ECRG4基因是通过 mRRNA 差异显示技术从正常食管组织和高癌家族中分离出的一条差异表达序列[2]。早期有研究表明ECRG4 高表达于大量正常组织中，但在食管癌组织及许多其他肿瘤组织中低表达，被初步认定为候选抑癌基因，且认为ECRG4 的表达过量能够抑制肿瘤细胞的生长增殖[3]。

ECRG4主要是通过启动子DNA 甲基化过程参与基因表达调控，ECRG4高甲基化在胃癌、食管癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤组织中频繁出现[4-5]。然而，对于 ECRG4 基因甲基化在肝细胞癌中的研究目前尚未有相关报道。本研究发现， 肝癌组织、癌旁组织ECRG4 蛋白低表达百分率分别为78.00%(40/50)和44.00%(28/50),明显高于正常组织蛋白低表达百分率9.68%(3/28)；肝癌组织、癌旁组织ECRG4 基因甲基化的检出率分别为 58%(29/50)、32%(16/50)，高于正常组织ECRG4 基因的3.2%(1/31)，提示ECRG4 基因在HCC中表达下调，且其启动子区出现高甲基化，此结论与既往ECRG4 基因在其他肿瘤中的研究结果大致相同。根据既往关于抑癌基因 ECRG4的理论研究可发现ECRG4 基因主要是通过参与了NF-KB 信号通路的转录激活，下调 NF-KB 通路的效应分子的表达，阻断细胞的增殖，使细胞周期停滞于 G1-S 期[6]。

本研究发现，ECRG4 基因在HCC组织中的表达下调与其异常甲基化表现为明显的相关性，推测 ECRG4 基因的异常甲基化在HCC组织中具有肿瘤特异性，可能导致 ECRG4 对NF-KB信号通路的调控失灵，HCC细胞增殖能力增强，与HCC的发生、发展过程密切相关。因此，一定程度上，可以推测ECRG4 基因可作为HCC早期诊断的1种特异性指标，并辅助性用于监测HCC的发生、发展。最重要的是ECRG4 基因可作为进一步研究HCC诊治的潜在分子标志物和治疗靶点。因此，我们的研究中指出的ECRG4 的低表达及高甲基化在HCC的发生、发展中发挥了重要作用这一研究结果具有一定的理论与临床实际意义，当然，本研究一定程度上受到实际条件的限制，样本量有限，日后还需要增加样本量来进一步验证，其具体的分子生物学作用机理也值得进一步深入研究。

ECRG4 基因在HCC组织中表达明显高于癌旁组织和正常组织，这与ECRG4 基因启动子区的异常甲基化密切相关，并在HCC的发生、发展中发挥重要作用。因此，可进一步探究ECRG4 基因的抑癌作用，为探索肝细胞肝癌的临床诊断与治疗新途径提供新方向。

[1] 张真瑜.TIPE1在肝细胞肝癌中的作用及机制研究〔D〕.山东大学,2013.

[2] 马尚林，李文梅，游颜杰.卵巢癌中 ECRG4 基因启动子甲基化的研究〔J〕.现代肿瘤医学,2016,24(10):1623-1625.

[3] Li LW，Yu XY，Yang Y，et al.Expression of esophageal can- cer related gene 4(ECRG4)，a novel tumor suppressor gene，in esophageal cancer and its inhibitory effect on the tumor growth in vitro and in vivo〔J〕.Int J Cancer,2009,125(7):1505-1513.

[4] Jia J,Dai S,Sun X,et al.A preliminary study of the effect of ECRG4 overexpression on the proliferation and apoptosis of human laryngeal cancer cells and the underlying mechanisms〔J〕.Mol Med Rep,2015,12(4):5058-5064.

[5] Baird A，Lee J，Podvin S，et al.Esophageal cancer-related g- ene 4at the interface of injury，inflammation，infection，and malignancy〔J〕.Gastrointest Cancer，2014,2014(4):131-142.

[6] Chen J，Liu C，Yin L，et al.The tumor-promoting function of ECRG4 in papillary thyroid carcinoma and its related mechanism〔J〕.Tumour Biol,2015,36(2):1081-1089.

(编辑：吴小红)

Expression of Esophageal Cancer Related Gene 4(ECRG4)in Hepatocellular Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

HUANGQin.

ShanghaiSixthPeople'sHospitalofEasternHospital,Shanghai,201306

Objective To study the expression of esophageal cancer-related gene 4(ECRG4)in hepatocellular carcinoma(HCC)and the methylation condition of ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissues,and their clinical significance.Methods Immunohistochemistry and MSP-polymerase chain reaction(PCR)were used to detect the protein expression level of ECRG4 and its methylation condition in 50 cases of HCC tissues,the adjacent non-tumor tissues and in 31 cases of normal liver tissue respectively.Explore the correlation between the protein expression of ECRG4 and the methylation condition.Results The protein expression level of ECRG4 in HCC tissues and adjacent non-tumor tissues both were significantly lower than normal liver tissues(P<0.05).The protein expression level of ECRG4 in HCC tissues was significantly lower than adjacent non-tumor tissues(P<0.05).The methylation rates of ECRG4 of promoter region in gastric cancer tissues were significantly higher than adjacent non-tumor tissues and normal gastric tissues(P<0.05).The low expression level and methylation rates of ECRG4 had significantly positive correlation(P<0.05).Conclusion The down-regulation of ECRG4 expression is associated with high methylation of ECRG4 promoter region in gastric cancer tissues，which is of great importance for the occurrence and development of HCC.

Hepatocellular carcinoma;Genes ECRG4;Tumor metastasis

201306 上海市第六人民医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.011

R735.7

A

1001-5930(2017)01-0034-03

2016-09-07

2016-12-15)