三氧化二砷对人子宫内膜癌细胞裸鼠模型中Caspase-3表达的影响

王明芳 张文剑 王新红 邢海青 赵园园

三氧化二砷对人子宫内膜癌细胞裸鼠模型中Caspase-3表达的影响

王明芳 张文剑 王新红 邢海青 赵园园

目的 通过建立人子宫内膜癌细胞HEC-1-B裸鼠模型，检测不同浓度三氧化二砷(As2O3)对移植瘤细胞Caspase-3表达的影响，并探讨As2O3的作用机制。方法 建立人子宫内膜癌HEC-1-B细胞皮下移植瘤模型，按编号随机分为实验组即As2O3低(1.0 mg/kg)、中(2.5 mg/kg)、高(5.0 mg/kg)剂量组、空白对照生理盐水(NS)组及阳性对照顺铂组(5.0 mg/kg)，连续腹腔给药8天后，通过流式细胞仪及实时荧光定量RT-PCR 检测移植瘤内Caspase-3相对表达量。结果 与生理盐水组比较，低、中浓度As2O3及顺铂均可上调Caspase-3的表达(P<0.05)，但高浓度组上调不明显(P>0.05)。与顺铂组比较，As2O3低剂量组作用最明显，差异有统计学意义(P<0.05)；但与中、高浓度组比较，差异无统计学意义。结论 低浓度As2O3能上调人子宫内膜癌细胞内Capase-3的表达，且优于顺铂，可能是三氧化二砷诱导细胞凋亡的作用机制之一。

三氧化二砷；子宫内膜癌；Caspase-3

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:009～011)

三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)俗称砒霜，治疗血液病效果显著，而且对于某些实体瘤尤其是肝癌的治疗亦见疗效[1]，其抗肿瘤作用及其机制日益受到广大学者的广泛关注[2]。我们已在前期实验中证实了As2O3对子宫内膜癌细胞的抑制增殖作用，本实验旨在探讨As2O3在体内抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株及实验动物 人子宫内膜癌细胞株HEC-1-B细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。Balb/c-nu裸小鼠，40 只，4～6 周龄，雌性，体质量15～18 g，购自苏州贝尔达实验动物有限公司，饲养于SPF(specific pathogen free condition)级动物实验室。

1.1.2 药物与试剂 As2O3购自哈尔滨伊达药业有限公司，顺铂注射液购自豪森药业股份有限公司，多克隆活性Caspase-3抗体购自BD公司，引物及荧光探针由上海生物公司合成，Trizol试剂盒购自In-vitrogen公司，Real-Time PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与动物实验模型的建立 将HEC-1-B细胞株贴壁培养于含有10%胎牛血清、双抗(青霉素100 u/mL，链霉素100 u/mL)的DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2温箱中，2天更换1次培养液，当细胞80%融合时传代培养。收集对数生长期的细胞，胰酶消化，制备成浓度3×107单细胞悬液0.2 mL，在超净工作台内接种于裸鼠的腋下，8天后均形成直径0.5 cm以上的移植瘤。

1.2.2 裸鼠分组及给药 将其按编号随机分为5组，分别设为生理盐水组，顺铂组(5.0 mg/kg)，As2O3低剂量组(1 mg/kg)、As2O3中剂量组(2.5 mg/kg)、As2O3高剂量组(5.0 mg/kg)。将As2O3和顺铂按比例(1∶100)在无菌条件下配成目标浓度，用无菌注射器抽取0.2 mL注入裸鼠腹腔，共给药8天。24 h时后将裸鼠称重后用摘眼球取血法处死，剥离肿瘤切块后分别用无水乙醇、液氮速冻备用。

1.2.3 流式细胞测定 将经70%冰乙醇固定的部分肿瘤标本，在超净工作台内用研磨棒研碎，用400目滤网过滤，低速离心(800 r/min)去除碎片，PBS洗涤后，制成单细胞悬液，采用triton细胞打孔后加入PE标记的活性Caspase-3抗体，同时设立空白染色对照组，染色半小时后通过流式细胞仪进行Caspase-3活性的测定。采用Cellquest3.1f收集细胞，用ModfitLTV2.0软件系统分析结果。

1.2.4 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 将液氮冻存肿瘤标本，剪成小块并研磨成碎片，按照RNA提取说明书方式提取RNA，分光光度计检测所提RNA260/280吸光值，选取比值在1.8～2.0之间的RNA样本，按照TaKaRa反转录体系要求(反应条件为37° 15 min反转录反应，85° 5 s 失活反应)合成cDNA，以GDPT为管家基因，应用Rotor-Gene 3000 荧光定量PCR仪(Corbett Research 公司)进行PCR反应。用Roche Light Cycler probe design software 2.0软件设计引物及探针，由上海生工公司合成。Caspase-3前引物序列：5’-AAATACCAGTGGAGGCCCGACTT-3’，后引物序列：5’-AAGCTTGTCGGCATACTGTTTCA-3’;Taq探针序列：5’-TGGCTCCTGGTT CATCCAGTCGCGCTT-3。GDPH前引物序列：5’-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，后引物序列：5’-GGCCATCCACAGTCTTCT-3’；Taq探针序列：5’-AAGA TCATCA GCA A TGCCTCCTGC-3’。按TAKARA说明书进行PCR荧光定量反应，PCR反应条件：预变性95°10 s，1cycle，PCR反应95° 5 s，60° 20 s，45cycle。测定CT值，采用2-△△CT法进行Caspase-3基因表达相对定量分析，CT值为荧光信号达到阈值时的循环数，△CT为同一样本达到阈值时靶基因Caspase-3与对照基因GDPH扩增所需的循环数差值即△CT=CT(Caspase-3)-CT(GDPH)，2-△△CT值代表经GDPH校正后的靶mRNA的数目。公式：F=2-[(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)-(待测样品目的基因平均Ct值-待测样品管家基因平均Ct值)]

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 流式细胞仪检测移植瘤内Caspase-3活性结果

前期实验中应用流式细胞仪检测到低浓度As2O3组和顺铂组均出现典型的细胞凋亡表现——亚G1峰，证实As2O3有诱导子宫内膜癌细胞凋亡的作用。本实验进一步测定Caspase-3活性，发现与空白对照组比较，不同浓度的As2O3作用强度不同，其中低剂量As2O3组的荧光强度最强，说明其Caspase-3活性最大，顺铂组次之，生理盐水组强度最小，说明Caspase-3活性最小。

2.2 Real-time PCR 检测移植瘤内Caspase-3的表达

根据荧光定量曲线(图1)，测定CT值，规定生理盐水组基因表达量为1，则得顺铂组及低、中、高剂量As2O3组基因表达相对量，通过表1可见低、中剂量As2O3组和顺铂组Caspase-3基因表达量明显高于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.05)；但高剂量组与生理盐水组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，虽然数值上高于生理盐水组。与顺铂组比较，As2O3低剂量组作用最高，有统计学差异(P<0.05)；而中、高剂量组与顺铂组比较无统计学差异(P>0.05)。说明As2O3低剂量组对Caspase-3表达的影响强于顺铂。

3 讨论

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)近年发病率呈明显上升和年轻化趋势，死亡率高，危害性大。多个

表1 移植瘤内Caspase-3相对定量分析

注：a指与生理盐水组比较，P<0.05；b指与顺铂组比较，P<0.05。

图1 Caspase-3荧光定量曲线

实验证实在子宫内膜癌中半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的表达很低甚至无表达，明显低于正常子宫内膜，而且表达水平越低，分化越差，提示子宫内膜癌凋亡失控与Caspase-3表达减少有密切关系[3]。三氧化二砷是一种细胞原浆毒物质，可以通过多种机制多靶点诱导细胞凋亡，其中三氧化二砷可以破坏线粒体跨膜电位，在线粒体损伤应答刺激下激活细胞内的Caspase-3，活化的Caspase-3再瀑布式激活Caspase-2，6，8，10等，最终水解核酸及细胞骨架蛋白，引起细胞凋亡[4]，Caspase-3被认为是凋亡事件的真正执行者[2]。

本实验中通过建立裸鼠模型，通过2种不同的检测方法，均发现NS组Caspase-3的表达最低，经过三氧化二砷和顺铂处理后Caspase-3的表达均有所增加，其中低浓度组效果最明显，中浓度组次之，有统计学意义，证实三氧化二砷能上调Caspase-3的表达。说明三氧化二砷上调Caspase-3可能是诱导子宫内膜癌细胞的凋亡的作用机制之一。多数研究表明，三氧化二砷抗肿瘤作用具有浓度、时间依赖关系，在低剂量时具有抑制细胞增殖、诱导凋亡的作用，高剂量时起细胞毒作用，造成病理性死亡[5]。这种效应的强度和细胞型别依赖性与ROS的水平不同有关，最终不同水平的ROS通过影响Caspase-3激活的活性及ATP水平决定细胞命运，出现不同的死亡方式[6]。本研究中发现三氧化二砷和顺铂均可影响Caspase-3的活性，但发现不同浓度的三氧化二砷对Caspase-3的影响不同，其中低浓度

三氧化二砷的作用最明显，并高于顺铂对Caspase-3表达的影响，而高浓度组作用效果最差，进一步证实，三氧化二砷调节Caspase-3的作用与浓度相关，以低浓度最适宜。但与体外实验不同的是，本实验中三氧化二砷的抗子宫内膜癌作用不存在典型的浓度依赖关系。由于三氧化二砷治疗剂量与中毒剂量接近，增加药物剂量，就有增加毒性和副作用的可能。因此探索合适的剂量，达到最大效度的抑瘤作用而不增加毒副作用，有待于进一步的深入研究。

综上所述，三氧化二砷可以上调Caspase-3的表达，可能是诱导子宫内膜癌细胞凋亡的机制。但三氧化二砷诱导细胞凋亡的机制是多通路、多靶点的，需要进一步深入研究并寻找最佳作用剂量。

[1] 邱从坤，陈国硕，王忠富.三氧化二砷治疗肝癌的研究进展〔J〕.中华介入放射科电子杂志，2015，3(1):52-55.

[2] Fulda S.Targeting apoptosis for anticancer therapy〔J〕.Semin Cancer Biol，2015，31(4):84-88.

[3] 孙 炯，杨留才，李仕红.Livin与Caspase-3在子宫内膜癌组织中的表达水平及相关性研究〔J〕.医学综述，2014，20 (9):1708-1710.

[4] Matos AJ，Santos AA.Advances in the understanding of the clinically relevant genetic pathway and molecular aspects of canine mammary tumours;part Ⅰ proliferation apoptosis and DNA repair〔J〕.Vet J，2015，205(2):136-143.

[5] 尹卫华，胡小雄，范惠珍，等.不同剂量三氧化二砷静滴联合适形放疗治疗中晚期原发性肝癌〔J〕.山东医药，2014，54(3):32-34.

[6] Ghaffari SH，Momeny M，Bashash D，et al.Cytotoxic effect of arsenic trioxide on acute promyelocytic leukemia cells through suppression of NF-κβ-dependent induction of hTERT due to down-regulation of pin 1 transcription〔J〕.Hemaology，2012，17(4):198-206.

(编辑：甘 艳)

EFFECT of Arsenic Trioxide on Caspase-3 in Nude Mice Models of Human Endometrial Carcinoma Cell Lines(Hec-1B)

WANGMingfang，ZHANGWenjian，WANGXinhong，etal.

TheAffiliatedYiduCentralHospitalofWeifangMedicalUniversity，Qingzhou，262500

Objective To study the effect of arsenic trioxide(As2O3)on expression of Caspase-3 in nude mice models of human endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B).Methods The nude mice models of endometrial carcinoma cell lines(Hec-1B)were randomized into 5 groups via number，then they were treated with NS，DDP，increasing concentrations of As2O3(1.0 mg/kg，2.5 mg/kg，5.0 mg/kg)by intraperitoneal injection.The Caspase-3 expression was detected by flow cytometry and real-time PCR.Results Compared with NS group，the As2O3(1 mg/kg、2.5 mg/kg)groups and DDP group increased significantly the expression of Caspase-3(P<0.05).But As2O3(5 mg/kg)group hadn’t distinguished effection.Compared with DDP group，the As2O3(1 mg/kg)group was statistically significant(P<0.05)，but the As2O3(2.5 mg/kg、5 mg/kg)groups weren’t.Conclusion(1 mg/kg)As2O3can increase the expression of Caspase-3，and was superior to DDP，the action may be one of mechanisms of arsenic trioxide inducing apoptosis.

Arsenic trioxide(As2O3);Endometrial carcinoma;Caspase-3

山东省卫生厅青年基金资助项目(编号：2001CA2CKB6)

262500 山东省潍坊市益都中心医院(王明芳，张文剑，王新红，邢海青)；266005 青岛大学医学院附属医院(赵园园)

赵园园

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.003

R737.33

A

1001-5930(2017)01-0009-03

2016-09-30

2016-12-08)