体外诱导的粘蛋白抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞抗乳腺癌的研究

李 帆 姬 静 史鹏燕 董文娟 刘 勇

体外诱导的粘蛋白抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞抗乳腺癌的研究

李 帆 姬 静 史鹏燕 董文娟 刘 勇

目的 制备携带粘蛋白(MUC1)抗原基因的重组腺相关病毒(AAV/MUC1)，研究其感染树突状细胞(DC)所诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性杀伤肿瘤细胞的活性。方法 应用分子生物学方法制备高低度的重组腺相关病毒(AAV/MUC1)。AAV/MUC1体外感染外周血单核细胞，诱导分化为DC。DC与T淋巴细胞混合，刺激产生CTL。流式细胞技术检测DC和CTL的分化和功能指标，MTS方法检测CTL的杀伤活性和特异性。结果 成功制备的重组病毒(AAV/MUC1)滴度为6×1010拷贝/ml。感染单核细胞率为84.27%。所获得的CTL对MUC1阳性的乳腺癌细胞株的杀伤率为(46.32±0.07)%。其杀伤作用具有MUC1抗原特异性和MHC-I类分子限制性的特征。结论 以MUC1抗原为靶点的CTL可有效地杀伤乳腺癌细胞，为乳腺癌提供了一条新的治疗途径。

树突状细胞；细胞毒性T淋巴细胞；粘蛋白；腺相关病毒；乳腺癌

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:012～015)

粘蛋白(MUC1)又称糖类抗原CA15-3，是1种肿瘤相关抗原，具有较强的免疫原性。MUC-1在90%的乳腺癌中高表达，且MUC-1的表达量与乳腺癌患者的瘤负荷量成正相关[1-2]。肿瘤细胞表达的MUC1与正常细胞有所不同，是免疫细胞攻击的重要靶点[3]。本研究的目的是以MUC1作为乳腺癌治疗的靶点，为建立一种有效的靶向性细胞免疫治疗的方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 载体、细胞和主要试剂

腺相关病毒(AAV)载体构建系统(美国阿肯色大学赠送)，细胞株(ATCC公司)，细胞培养基和细胞因子(Life公司)，限制性内切酶和MTS试剂(Promega公司)，单克隆抗体(BD公司)。引物由Invitrogen公司合成。MHC-I类分子配型相符的患者外周血细胞和MUC1抗原阳性的肿瘤组织标本来源于深圳市第二人民医院。

1.2 携带MUC1基因的重组腺相关病毒的包装和鉴定

采用常规RT-PCR方法从肿瘤组织中获得MUC1 cDNA。PCR引物序列为ATGAATTCGCCTGCCTGAATCTGTTCTG和ATGGATCCAACCTGAGTGGAGTGGAATG。采用常规的分子克隆技术，将MUC1 cDNA插入腺相关病毒载体，获得AAV/MUC1质粒后，转染293细胞，获得AAV/MUC1病毒颗粒。按照斑点杂交法检测病毒滴度。

1.3 制备MUC1抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

按照常规方法，从80 ml乳腺癌患者的外周静脉血中分离出人外周血单个核细胞，再分离出单核细胞和T淋巴细胞，在AIM-V培养基中培养。单核细胞培养体系中加入100 MOI AAV/MUC1，600 IU/ml GM-CSF以及100 IU/ml IL-4。5天后收获悬浮的DC，并与T淋巴细胞混合，并加入20 IU/ml IL-2。继续培养9天后收获细胞。

1.4 AAV/MUC1感染效率的检测

收获1.3培养的DC，按常规方法，应用流式细胞技术检测MUC1阳性细胞率，确定病毒感染单核细胞的感染率。

1.5 DC和CTL的功能检测

应用常规的流式细胞技术分别检测研究组(感染)和对照组(未感染)的细胞，DC的检测指标为CD14、CD80、CD83、CD86、IL-10和IL-12，CTL的检测指标为CD8、CD25、CD4、CD69和IFN-γ。

1.6 CTL特异性体外杀伤实验

采用常规的细胞毒性检测(MTS)方法。以上述所获得的CTL为效应细胞，MUC1阳性细胞株MCF7以及MUC1阴性细胞株LNCap、HepG2为靶细胞[4-6]，细胞混合培养6 h后，测定OD值。计算效应细胞的杀伤率。

1.7 统计学分析

应用PASW Statistics 18统计软件。计量方法采用2组数据的比较均值t检验。

2 结果

2.1 AAV/MUC1质粒构建及其病毒鉴定结果

RT-PCR结果如图1A所示，MUC1 cDNA长度为927bp，与电泳结果一致。所构建的AAV/MUC1质粒的酶切鉴定结果如图1B所示，在927bp的位置出现阳性条带，证明载体构建成功。如图2所示，AAV/MUC1的斑点深浅与6×1010copys/ml的标准品相近，因此确定所获得的AAV/MUC1病毒滴度为6×1010copys/ml。

A为MUC1 cDNA PCR扩增结果电泳图；B为重组 MUC1腺相关病毒载体的双酶切鉴定结果图；1-4 为酶切结果；5为核酸Marker(0.1～10kb)。图1 电泳图

图2 斑点杂交法检测AAV/MUC1病毒滴度结果

2.2 AAV/MUC1的感染率

如图3所示，AAV/MUC1感染后的DC，其MUC1抗原的表达率为84.27%，即病毒的感染率。

2.3 DC的功能检测结果

AAV/MUC1感染的DC表达CD80、CD83、D86和IL-12的平均水平分别为88.23%、80.64%、88.81%和72.69%，明显高于对照DC(P<0.01)，而CD14(5.76%)以及IL-10(3.06%)水平无明显差别(P>0.05)，提示受病毒感染的DC的成熟度，抗原提呈功能较好，并倾向于刺激CTL产生。

2.4 CTL的功能检测结果

在AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL中，CD69+CD8+双阳性细胞的平均百分率为58.22%，明显高于对照组(34.08%,P<0.01)，提示具有杀伤活性的CTL较多。而CD25+CD4+双阳性的Treg细胞的平均百分率为7.83%，与对照组(11.56%)比较无显著性差异(P>0.05)。

2.5 CTL表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测结果

与对照组相比，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL的IFN-γ表达水平较高，平均为44.26%，明显高于对照组(20.34%)，表明CTL的杀伤活性较高(P<0.01)。

2.6 CTL的特异性体外杀伤实验结果

如图4A所示，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL能有效地杀伤(裂解)MUC1阳性的乳腺癌细胞，对MCF7细胞株的杀伤率为(46.32±0.07)%，而对MUC1阴性的细胞株(LNCap和HepG2)没有明显的杀伤作用，杀伤率为(11.40±2.99)%和(9.94±3.33)%，而无AAV激活的CTL，其对MCF7的杀伤率为(12.47%±3.68)%。MCF7细胞组的杀伤率与其它组相比较存在显著性差异(P<0.01)。如图4B所示，在进行杀伤试验之前，加入MUC1抗体或MHC-I类分子抗体，均可有效地抑制CTL杀伤肿瘤细胞的活性，杀伤率分别下降为(10.80±4.01)%和(10.91±3.29)%，与上述结果均存在显著性差异(P<0.01)。

A为AAV/MUC1感染后的DC；B为对照组DC。图3 流式细胞仪检测MUC1抗原表达情况

A横坐标以AAV/MUC1+MCF7为例，其代表的是AAV/MUC1激 活的CTL对MCF7的杀伤活性；B中MUC1抗体和MHC-I抗体代表CTL与MCF7混合前添加MUC1抗体或MHC-I类分子抗体。图4 CTL的特异性体外杀伤实验结果

3 讨论

MUC1在正常细胞表达较弱或无表达，但在包括乳腺癌的多种肿瘤组织中高表达。由于癌组织中的MUC1糖基化不完全，使得MUC1核心蛋白暴露在细胞表面，容易为免疫系统发现，且免疫原性较强，因此，MUC1是较理想的免疫攻击的靶点。目前，将MUC1作为免疫治疗靶点的研究却很少。本研究的创新性在于将MUC1基因克隆至AAV病毒载体中，并制备相应的感染性病毒。被感染的DC将MUC1抗原信息提呈给T淋巴细胞，刺激其分化成为特异性杀伤乳腺癌细胞的CT。此研究结果具有临床应用价值。

AAV载体是已知的最安全的病毒载体，不导致任何人体生理改变或病理变化。美国国立卫生研究院(NIH)和食品及药品管理局(FDA)连续多年宣布AAV是用于基因治疗的最安全的病毒载体。AAV病毒本身免疫原性极低，而且本研究证实其对单核细胞具有较高的感染率(84.27%)，明显高于通常的15%～30%蛋白转染效率。因此，无论是实验室研究和临床应用，通过AAV携带抗原基因感染DC是DC负载抗原的最佳方法之一。

CD83分子是成熟DC的标志物，共刺激分子CD80和CD86是激活T淋巴细胞的必要信号[7]。这些CD分子表达水平与DC的成熟度和诱导细胞免疫反应等功能直接相关。DC的IL-12 的表达水平与DC诱导细胞免疫反应呈正相关，而IL-10的表达水平与DC诱导免疫抑制反应呈负相关[8]。本研究结果表明被AAV/MUC1感染的DC与对照组相比，CD80，CD83和CD86分子的表达水平显著性地提高，提示DC具有强大的诱导细胞免疫反应的能力。本研究发现的高水

平的IL-12表达，低水平的IL-10表达，证明被AAV/MUC1感染的DC倾向于激发细胞免疫反应，产生CTL。

在T淋巴细胞亚群中，CD25+CD4+细胞代表的是调节性T淋巴细胞(Regulatory T cell,Treg)，其功能是抑制细胞免疫反应。CD69+CD8+细胞则代表被激活的CD8阳性T细胞[9]，即CTL，其主要功能是特异性裂解抗原阳性的靶细胞，具有MHC-I类分子限制性。在AAV/MUC1感染的DC刺激的T淋巴细胞亚群中，CD8+CD69+T细胞数量明显增多，而CD25+CD4+Treg细胞数量减少，有利于CTL发挥最大的裂解靶细胞作用。抗原激活成熟的CD8淋巴细胞分泌IFN-γ，IFN-γ是免疫应答的正向调节剂，不仅能通过多种机制上调免疫应答，且能直接杀伤肿瘤和病毒感染的细胞[10]。本研究所获得的CTL高表达IFN-γ，证明该CTL杀伤(裂解)乳腺癌细胞的功能较强。

针对肿瘤细胞的杀伤实验证明，AAV/MUC1感染的DC所激活的CTL对于MUC1阳性的乳腺癌细胞具有较强的杀伤(裂解)作用，但对于该抗原阴性的细胞无杀伤作用。进一步地，在杀伤实验之前，分别以MUC1抗体和MHC-I类分子抗体封闭乳腺癌细胞之后，CTL对于乳腺癌细胞的杀伤作用被抑制。本研究证明该杀伤作用具有MUC1抗原特异性，即靶向性，且具有MHC-I分子限制性的。CTL的杀伤作用特征明显。

本研究证明AAV/MUC1感染的DC及其激活的CTL功能较强，且CTL能有效地杀伤MUC1抗原阳性的乳腺癌细胞，杀伤作用具有特异性、靶向性特征。因此本研究结果为今后的临床应用奠定了基础。

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(编辑：吴小红)

Research on MUC1 Antigen-specific Cytotoxic T Lymphocytes for Breast Cancer

LIFan，JIJing，SHIPengyan，etal.

ShenzhenImmuclinBiomedIncorporated,Shenzhen,518000

Objective To study recombinant adeno-associated virus with human MUC-1 antigen gene(AAV/MUC1),and observe anti-tumor cell effects of MUC1 antigen-specific cytotoxic T lymphocytes(CTL)stimulated by dendritic cells(DC)infected by AAV/MUC1.Methods High titers of infectious AAV/MUC1 were packaged with molecular biological methods.After the monocytes were infected by AAV/MUC1,the dendritic cells(DC)were induced and generated.To generate CTL the DC were mixed with T lymphocytes.Function of the DC and CTL were detected by flow cytometry.Killing activity of the CTL against the breast cancer cells was tested by MTS.Results AAV/MUC1 was successfully generated with titers at 6×1010copies/ml.The infection rate in monocytes was 84.27%.The killing rates of the CTL were(46.32±0.07)%.The killing activity was MUC1 antigen-specific and MHC class I molecule-restricted.Conclusion MUC1 antigen-specific CTL’s effectiveness in killing breast cancer cell provides a new option in breast cancer treatment.

Dendritic cells;Cytotoxic T lymphocytes;MUC1;Adeno-associated virus;Breast cancer

深圳市战略新兴产业发展专项资金(编号：JSGG20141118110447437)

518000 深圳益世康宁生物科技有限公司(李 帆，姬 静，史鹏燕，董文娟)；518000 深圳市第二人民医院(姬 静)；518000 深圳北京大学香港科技大学医学中心(刘 勇)

刘 勇

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.01.004

R737.9

A

1001-5930(2017)01-0012-04

2016-08-19

2016-12-15)