过敏性哮喘中肺部树突状细胞体内趋化实验研究*

牛 睿 林 燕 王 鹏 伊淑莹

(泰山医学院，山东 泰安 271000)

过敏性哮喘中肺部树突状细胞体内趋化实验研究*

牛 睿 林 燕 王 鹏 伊淑莹

(泰山医学院，山东 泰安 271000)

目的 研究过敏性哮喘中DC与CD4+T淋巴细胞的相互作用，探讨过敏性哮喘中DC在体内是否可以直接趋化CD4+T细胞，从而为哮喘治疗提供新的方向。方法 分选C57BL/6哮喘模型小鼠肺部DC注射到小鼠后背气泡中，细胞注射12 h后，流式细胞仪检测气泡内CD4+T淋巴细胞数目。结果 与仅注射PBS的对照相比，注射DC组趋化至气泡内的CD4+T细胞显著上升。结论 本研究表明过敏性哮喘中DC在体内可以直接趋化CD4+T细胞。

过敏性哮喘；树突状细胞；CD4+T淋巴细胞

过敏性哮喘是哮喘的最主要形式，是一种以气流阻塞、黏液高分泌和淋巴细胞、嗜酸粒细胞及肥大细胞浸润气道壁为特征的常见慢性呼吸道疾病。流行病学研究表明,全球约有3亿成年哮喘患者，发病率高达18%左右，其中约80%为过敏性哮喘[1]。经典免疫学说认为哮喘的发病机制与辅助性T细胞亚群即Thl/Th2功能失衡密切相关。树突状细胞(DC)作为功能最强的专职抗原提呈细胞处于机体免疫应答的中心环节。DC构成性表达MHC II类分子和共刺激分子如CD80、CD86等，具有在外周局部组织摄取抗原后，迁移到相应淋巴器官并刺激初始T细胞活化和增殖的独特功能；DC分布广泛，通过表达一系列能够识别“危险信号”的“模式识别受体”，收集局部微环境中的各种危险信号，并传递给T淋巴细胞，从而启动获得性免疫反应，因此DC是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁[2]。本研究提供了研究细胞体内趋化作用的方法，并研究了过敏性哮喘中DC与CD4+T细胞的直接作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 常规小鼠雌性C57BL/6(H-2Kb)近交系小鼠，7～8周龄，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要用品与试剂 鸡卵清蛋白(Albumin from chicken egg white)购自Sigma公司出产，免疫佐剂明矾(Al(OH)3，alum)购自Thermo Scientific Imject TM；1×磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)购自Thermo公司。流式抗体percy-cy 5.5-CD11c、e450-ly6c、A780-CD11b购自eBioscience和PE-cy7-IA/IE购自Biolegend，PE-Siglec F购自BD Bioscience。用BD FACS Aria II分选型流式细胞仪进行细胞分选。

1.3 实验方法 (1)小鼠麻醉并剃毛：1%苯巴比妥钠100 μl腹腔注射，麻醉正常C57BL/6小鼠，待小鼠麻醉后剔除背部毛发。(2)背部皮下制备气泡：用5 ml注射器皮下注入3 ml气体，在小鼠背部形成气泡，3天之后要再注射1次，保证气泡内充气为3 ml。两次注射空气后的气泡小鼠如图1所示。(3)FACS分选DC并注射入气泡： 按照文献报道的实验方法[4]，诱导过敏性哮喘小鼠模型。以免疫佐剂明矾(alum)加入六型 OVA (20 μg)，震荡混匀充分乳化OVA后， d-28给予小鼠腹腔注射做初次致敏，d-14再次相同剂量进行第二次腹腔致敏，然后在0～2天之间用1%OVA (五型OVA)连续雾化3天，每次20 min，构建小鼠过敏性哮喘模型。制备C57BL/6哮喘模型小鼠肺部单细胞，流式抗体标记后分选肺部DC，将分选出的肺部 DC 细胞5万个注射入小鼠背部气泡内。(4)检测气泡中趋化的细胞数量：细胞注射12 h后，用PBS冲洗气泡并收集冲洗液，流式抗体染色，流式细胞仪检测。

图1 气泡小鼠

1.4 统计学方法 用 SPSS20.0对所得数据进行方差分析和χ2检测，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺部DC分选策略 制备哮喘小鼠肺单细胞并用多色荧光抗体标记后，去除粘连细胞及死细胞, 然后用SiglecF与CD11c去除嗜酸性粒细胞及肺泡巨噬细胞，进一步用CD11b及ly6c去除单核细胞及中性粒细胞，最后用流式细胞仪 (BD FACSAria)分选CD11c+IA/IE+ DC。分选策略如图2所示。

图2 肺部DC分选策略

2.2 DC趋化的CD4+T细胞统计 将分选出的肺部 DC 注射入小鼠背部气泡内12 h后，用PBS冲洗气泡并收集冲洗液，流式抗体染色，流式细胞仪检测分析各组内气泡内CD4+T细胞的数目，结果与仅注射PBS的对照组相比，注射哮喘小鼠肺部DC组趋化至气泡内的CD4+T细胞显著上升。说明哮喘中肺部DC在在体内可以直接趋化CD4+T细胞。

表1 气泡小鼠中肺部DC对CD4+T细胞的趋化作用

注：与PBS 对照组相比，*P<0.05。

图3 气泡小鼠中趋化CD4+T细胞数目

3 讨 论

过敏性哮喘患者体内THl/TH2免疫调节失衡是哮喘发生发展的重要机制，肺与气道粘膜中TH2细胞因子高表达，使TH1/TH2为主的免疫平衡向TH2倾斜，从而导致气道发生慢性炎症[3]。过敏性哮喘作为I型超敏反应，过敏性炎症的发生分为各个阶段，诱导阶段主要细胞为抗原提呈细，而DC是功能最强大的抗原提呈细胞，它们能够捕获外来抗原并且迁移到引流淋巴结，然后提呈给初始T细胞刺激免疫应答[5]。在某些病理状态下DC与初始T细胞结合力的变化会更加促进初始T细胞向TH2 型细胞的转变，有研究发现过敏体质的人群中，DC 会刺激初始T细胞向 TH2 方向分化。此外DC在迁移成熟中还可激活会刺激初始T细胞分化成记忆性T细胞,之后DC再次激活记忆性T细胞，在随后的自身免疫损伤中发挥重要作用[6]。本研究表明，哮喘中肺部DC在体内可以直接趋化CD4+T细胞。DC 与支气管哮喘发病机制的深入研究为哮喘治疗提供了新的方向。

[1] Bart NL, & Hamida H. The immunology of asthma[J]. Nat Immunol, 2015，16(1): 45-56.

[2] Kopf M, Schneider C, & Nobs S P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells[J]. Nat Immunol, 2014，16(1): 36-44.

[3] Wenzel SE. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches[J]. Nat Med, 2012,18: 716-725.

[4] Staudt V, Bothur E, Klein M, et al. Interferon-regulatory factor 4 is essential for the developmental program of T helper 9 cells[J]. Immunity, 2010, 33(2):192-202.

[5] Plantinga M, Guilliams M, Vanheerswynghels M, et al.Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen[J].I mmunity, 2013, 21,38(2):322-335.

[6] 高振家.2014.树突状细胞在支气管哮喘发病机制中的作用研究[J]. 中国医学工程，22(2)：194-196.

Chemotaxis study of pulmonary dendritic cells in vivo during allergic asthma

NIU Rui LIN Yan WANF Peng YI Shu-ying

(Taishan Medical University, Taian 271000,China)

Objective: To study the direct effect of dendritic cells (DC) on CD4+T lymphocytes in allergic asthma, and to explore whether DC can directly induce CD4+T lymphocytes in asthmatic mice, we performed this research. This study will provide a new direction for the treatment of asthma. Methods: Pulmonary DCs were sorted from the C57BL/6 asthmatic mice, and injected into the dorsal air pouches of the mice. The number of CD4+T lymphocytes in the air pouches was detected by flow cytometry after 12 hours of cell injection. Results: Compared with PBS control, the chemotactic CD4+T lymphocytes increased significantly after the DC injection. Conclusion: This study indicates that lung DCs in asthmatic mice can directly induce CD4+T lymphocytes in vivo.

allergic asthma; dendritic cells; CD4+T lymphocytes

国家自然科学基金项目(81401328 )，山东省自然科学基金项目(ZR2013HL064)，国家级大学生创新创业训练计划项目(201610439035)。

牛睿(1990—)，女，硕士研究生。

伊淑莹(1979—)，女，博士，副教授，主要从事超敏反应性疾病研究，E-mail：shuyingyi79@163.com.cn。

R563

A

1004-7115(2017)01-0006-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.01.002

2016-09-22)