脂联素及其基因单核苷酸多态性与广西壮族代谢综合征的相关性研究*

郑利平，杨 兰，陆俊佳，朱 旭

(广西壮族自治区南宁市第二人民医院医学检验科 530031)

脂联素及其基因单核苷酸多态性与广西壮族代谢综合征的相关性研究*

郑利平，杨 兰，陆俊佳，朱 旭△

(广西壮族自治区南宁市第二人民医院医学检验科 530031)

目的 探讨脂联素(APN)及其基因位点+45、+276 和-11377的单核苷酸多态性与广西壮族代谢综合征(MS)的相关性。方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测壮族MS组、壮族健康组、汉族MS组和汉族健康组(各100例)血清中APN浓度，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测APN基因位点+45T/G、+276G/T和-11377C/G的多态性。结果 (1)较同民族健康组，两个民族的MS组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和APN均显著降低，而BMI、空腹血糖(FPG)、收缩压、舒张压、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；(2)壮族、汉族MS组APN+45基因位点的TG和GG基因型频率明显比同族健康组升高，差异有统计学意义(χ2=14.319，P=0.001；χ2=11.631，P=0.003)。壮族、汉族MS组的APN+276位点TG和GG基因型明显高于同族健康组，差异有统计学意义(χ2=25.058，P=0.000；χ2=25.425，P=0.003)。4组的APN-11377位点绝大部分是野生型，虽等位基因分布频率略有差异，但差异均无统计学意义(P>0.05)；(3)两个MS组中APN+45位点为TT基因型的患者血清APN水平显著高于基因型为TG和GG型的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。APN+276位点为GG型的患者血清APN水平明显高于基因型为GT和TT型的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。结论APN+45位点G基因型和+276 位点T基因型导致血清中APN水平降低可能与广西地区壮族和汉族MS发生有相关性。

脂联素；基因多态性；壮族；代谢综合征

代谢综合征(metabolic syndrome，MS) 是一组以多种代谢性疾病或危险因素在个体聚集的综合征 。临床主要表现是高血压、血脂异常、糖耐量异常、凝血异常。胰岛素抵抗是MS的主要病理基础，贯穿于MS发生、发展的始终。脂联素(APN)是脂肪细胞分泌的特异性蛋白，具有调节血糖、血脂代谢，增强胰岛素敏感性，抗炎症，抗动脉粥样硬化，抗血小板聚集等生物作用。因此APN水平的改变可能引起MS发生、发展。本研究通过检测广西最大的少数民族，即壮族MS患者外周循环中APN水平及其基因位点+45T/G、+276 G/T和-11377C/G 基因多态型及等位基因的分布频率，探讨APN水平及基因位点与壮族MS的关系，从而为广西地区壮族MS防治提供全新视角。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择广西南宁市的壮族MS患者、壮族健康个体、汉族MS患者和汉族健康个体各100例。其中，壮族MS组：女48例，男52例，年龄46～75岁，平均53.1岁；壮族健康组：女45例，男55例，年龄50～71岁，平均53.9岁；汉族MS组：女45例，男55例，年龄47～78岁，平均54.3岁；汉族健康组：女47例，男53例，年龄49～72岁，平均54.4岁。入选标准：(1)3代以上未有与外族通婚的壮族或汉族家庭，第3代或以下个体纳入研究，且尽可能确保研究对象在其可追踪的历史上没有与外族通婚；(2)无遗传性疾病家族史及其他继发血脂、血糖升高的急、慢性疾病史。MS 的诊断参照《中国成人血脂异常防治指南》[1]。4组研究对象在年龄和性别上差异无统计学意义(P>0.05)。采样过程遵循知情同意原则，并通过询问确保样本间无血缘关系。

1.2 仪器与试剂 全自动生化仪(日本日立公司)；酶标仪(深圳雷杜生命科学有限公司)；核酸扩增仪(美国ABI公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)。凝胶成像仪(珠海黑马生物公司)；APN检测试剂(美国GBD公司)；全血DNA 抽提试剂(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 抽取研究对象空腹状态下静脉血5 mL，注入干燥管和EDTA抗凝管中。干燥管放置30 min后，低速离心(3 000 r/min)10 min，分离血清用于测定空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和APN的检测。EDTA抗凝管充分混匀，提取DNA用于APN基因位点多态性检测。

1.3.2 血清FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C和APN的检测 采用比浊法或比色法测定血清FPG 、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清APN，一切操作严格按照试剂说明书。

1.3.3 DNA制备 全血DNA的制备严格按照DNA提取试剂说明书操作，最后-20 ℃保存备用。

1.3.4 APN基因检测

1.3.4.1 反应体系 PCR混合反应液8.0 μL(含dNTP、buffer)，Taq酶 0.5 μL，无菌水37.5 μL，DNA模版2.0 μL和上、下游引物各1.0 μL，共50.0 μL反应体系。APN 3个基因位点引物序列见表1。

1.3.4.2 APN基因位点的扩增条件 APN+45和APN+276位点：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 1 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环； 72 ℃延伸7 min。APN-11377位点：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.3.4.3 APN限制性片段长度多态性分析 PCR扩展产物20 μL、buffer 3 μL，内切酶1 μL，无菌水6 μL，37 ℃孵育1 h后取5 μL在2%琼脂糖凝胶上点样。电压100 V，电泳30 min后在凝胶成像仪下观察电泳结果并摄像保存。3个基因位点酶切情况见表2。

表1 APN+45、+276和-11377基因位点引物序列

表2 APN3个基因位点酶切情况

2 结 果

2.1 4组临床一般资料及APN的比较 较同族健康个体，两个民族的MS组外周循环中HDL-C和APN水平均较健康组显著降低，而BMI、FPG、收缩压、舒张压、TG、TC、LDL-C明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。而壮族MS组与汉族MS组间的FPG、BMI、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C和APN略有差异，但差异并无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 研究对象临床资料的比较

a：P<0.05，与同民族健康组比较。

2.2 4组的3个APN基因位点多态性分析 健康组和MS组的APN+45、+276和-11377基因单核苷酸多态性经H-W平衡检验,均符合H-W群体遗传平衡法则(P>0.05),具有群体代表性。4组的APN+45和+276基因位点杂合程度较高，均以汉族MS组最高。4组APN-11377位点少见突变，均以野生型为主。 4组APN+45位点等位基因分布频率,发现壮族和汉族MS组的TG和GG基因频率明显比同族健康组升高，差异有统计学意义(χ2=14.319，P=0.001；χ2=11.631，P=0.003)；壮族MS组APN+45基因杂合程度略低于汉族MS组，差异无统计学意义(χ2=0.372，P=0.830)。APN+276位点等位基因分布频率同APN+45位点,壮族和汉族MS组的GT和TT基因频率明显比壮族和汉族健康组升高，差异有统计学意义(χ2=25.058，P=0.000；χ2=25.425，P=0.000)；壮族MS组APN+276基因杂合程度略低于汉族MS组，差异无统计学意义(χ2=0.193，P=0.908)。4组的APN-11377位点绝大部分是野生型，虽基因频率略有差异，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。电泳结果见图1。

表4 4组各基因型别频率检测结果(%)

M:marker;1:APN+276TT型;2:APN+276GG型;3:APN+276TG型;4:APN+45TT型;5:APN+45TG型;6:APN+45GG型;7:APN-11377CG型;8:APN-11377CC型。

图1APN3个基因位点扩增产物酶切电泳图

2.3MS组APN3个位点不同基因型与血清APN水平的影响MS组中APN+45位点携带TT型的患者血清APN水平显著高于基因型为TG和GG型的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。MS组APN+45位点TG型别的APN水平较GG型别的MS患者略高，但差异并无统计学意义(P>0.05)。MS组中APN+276位点携带GG型的患者血清APN水平显著高于基因型为GT和TT型的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。MS组APN+276位点GT型别的APN水平较TT型别的MS患者略高，但差异并无统计学意义(P>0.05)。MS组中APN-11377位点的CC型别和CG型别的APN水平差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 MS组APN+276G/T和-11377C/G不同基因型的血清APN水平

a:P<0.05，与同位点TT型比较。

3 讨 论

APN是脂肪组织分泌的一种特异性蛋白。可调节葡萄糖、脂质代谢，改善胰岛素抵抗，影响血管内皮功能和炎症反应[2-3]。APN基因位于人染色体3q27区域，该区域具有丰富的多态性[4]，有研究表明该区域是2型糖尿病、MS、冠心病的易感基因区域[5-7]。但APN基因多态性存在地区、种族差异,以致很多研究结果不一致,甚至不同地区的同一种族人群的研究也会有相互矛盾的结果产生[8]。因此研究广西地区壮族MS患者血清中APN水平和基因位点单核苷酸多态性，对明确该地区MS患者的发生、发展因素具有重要作用。

较同族健康个体，壮族和汉族MS组外周循环中APN水平显著降低，这与Kizer等[9]研究结果相似，提示血清中低APN水平可能与MS的发生、发展密切相关。壮族MS组APN水平略高于汉族MS组，这可能跟壮族MS组血脂、血糖、血压等临床指数略低于汉族MS组相关，间接证明了MS的发展与APN的水平相关。壮族和汉族MS组APN+45位点的TG、GG基因型分布频率明显高于该族健康个体，且携带G基因型的个体血清中APN水平降低，GG基因型个体APN水平显著下降，提示携带SNP+45G基因型个体所致的血清中低水平APN更易发展为MS，是MS的一个危险因素，这与国内外有关研究相似[7,9]。目前APN+276位点G/T变异的研究结果不一致，有研究表明APN+276基因多态性与肥胖个体的低APN水平相关[10]，也有研究表明该变异位点与MS不相关[11]。同APN+45位点，壮族和汉族MS组APN+276的GT、TT基因型明显高于同族健康个体，T等位基因携带的个体血清中APN水平明显降低，提示携带SNP+276T基因型的个体所致的血清中低水平APN更易发展为MS，是MS的另一个危险因素，这与相关研究结论一致[7,9]。两个民族MS组APN+45位点、APN+276位点等位基因分布频率与血清中APN水平虽略有差异，但差异并无统计学意义。提示APN+45位点、APN+276位点多态性在广西地区无民族差异性。有研究表明APN+45基因位点和+276基因位点存在一定的连锁不平衡[12]。但因此次研究主要遴选彼此没有血缘关系的研究对象作为研究对象，没有选择MS家系做研究，因此不能确定APN+45的G基因型和+276位点的T基因型的连锁不平衡。APN-11377基因位点在两个民族MS组和健康个体中以野生型为主，基因杂合程度均不高，且与血清中APN水平并不相关，提示SNP-11377基因多态性与MS不相关。这与桂北地区汉族体检人群的研究结论一致[13]。但与Lin等[14]研究表明血浆APN水平降低，是MS发生的一个危险因素的结论不一致。

总之，APN+45G基因型和APN+276T基因型所导致的血清中低APN水平可能与广西地区汉族、壮族MS患者的发生密切相关。将APN+45和APN+276基因位点作为MS的筛选基因之一有助于早期发现广西地区MS的易感人群。

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Study on correlation between adiponectin and it single nucleotide polymorphism with Zhuang metabolic syndrome in Guangxi*

ZhengLiping,YangLan,LuJunjia,ZhuXu△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NanningMunicipalSecondPeople′sHospital,Nanning,theGuangxiZhuangAutonomousRegion530031,China)

Objective To study the correlation between adiponectin (APN) and gene site APN+45,+276 and -11377 polymorphisms with Zhuang metabolic syndrome (MS) in Guangxi Region.Methods The levels of serum adiponectin in Zhuang MS patients,Han MS patients,Zhuang normal people and Han normal people(each of 100 cases)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method,and APN+45,APN+276 and APN-11377 polymorphisms were detected by using PCR-RFLP.Results (1) Compared with the same nationality normal control group,the APN and HDL-C levels of the two MS groups were significantly decreased,while BMI,FPG,systolic blood pressure,diastolic blood pressure,TC,TG and LDL-C were significantly increased,the differences were statistically significant (P<0.05);(2)the TG and GG genotype frequency of APN+45 loci in Zhuang and Han MS groups was significantly higher than that in the same nationality normal group,the differences were statistically significant (χ2=25.058,P=0.000;χ2=25.425,P=0.003).APN+276 loci TG and GG genotype frequency in Zhuang and Han MS groups significantly higher than that of same nationality normal group,the differences were statistically significant (χ2=14.319,P=0.001;χ2=11.631,P=0.003).The heterozygosis degree of APN+276 locus in the Zhuang and Han MS groups was significantly higher than that in the same nationality individuals,the difference was statistically significant(allP<0.05).Most of APN-11377 locus in the 4 groups was the wild type,although there was a slight difference in the distribution of allele frequencies,but the difference was not statistically significant (P>0.05).(3)The serum APN level in the patients with APN+45 TT genotype of the two MS groups was significantly higher than that in the patients with TG and GG genotype,and the differences were statistically significant (P<0.05).The serum APN level in the patients with APN+276 GG genotype was significantly higher than that in the patients with GT and TT genotype,and the differences were statistically significant (P<0.05).Conclusion The APN+45 G genotype and APN+276 T genotype resulted in the decrease of serum APN level,which may be associated with the occurrence of MS in Zhuang and Han nationality.

adiponectin;polymorphism;Zhuang nationality;metabolic syndrome

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.018

广西壮族自治区南宁市科技课题资助(20123135)。

郑利平(1966-)，主任检验师，本科，主要从事医学检验方面研究。△

E-mail:Lipingzheng88@163.com。

R

A

1671-8348(2017)02-0203-04

2016-07-22

2016-11-07)